摘要:目的通过克隆和表达人蛋白质磷酸酶CDC25A/B融合蛋白,探讨构建高通量靶向抗癌药筛选体系的途径。方法采用RT-PCR技术克隆人CDC25A/B催化区结构域cDNA序列,构建pGEX-4T-1-CDC25A/B原核表达质粒,表达和纯化携带还原型谷胱甘肽(GSH)标签的融合蛋白。以对硝基苯基磷酸盐(pNPP)为底物,在96孔板上建立分别以GST-CDC25A/B为靶标的筛选体系,应用维生素K3(VK3)进行验证性抑制剂筛选。结果成功表达和纯化了GST-CDC25A/B融合蛋白,建立了相应的高通量磷酸酶抑制剂筛选体系。在相同反应条件下,GST-CDC25B对pNPP的水解活性是GST-CDC25A的6倍。VK3对CDC25A/B的半数抑制浓度(IC50)分别为0.8和1.8μg/ml。结论通过表达和纯化CDC25A/B催化区结构域与GST的融合蛋白,可以高效率的建立靶酶抑制剂高通量筛选体系,为进一步研发VK3衍生物类新型靶向抗癌药奠定了基础。
关键词:靶向抗癌药 cdc25磷酸酶 gst融合蛋白 高通量筛选 对硝基苯磷酸盐
单位:北京大学基础医学院 北京100191 北京大学生命科学学院
注:因版权方要求,不能公开全文,如需全文,请咨询杂志社