摘要:目的:观察微小RNA155(miR-155)对端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关蛋白特异性蛋白1(SP1)及转录因子E2F2重组质粒表达的影响,为进一步研究miR-155调控肿瘤细胞hTERT表达的机制提供实验基础。方法采用生物信息学预测软件TargetScan和Miranda预测SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR是否是人miR-155的作用靶点。针对SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR设计互补的两条寡核苷酸,包括目标序列(即SP1、E2F2野生型序列)及突变序列(SP1-mu、E2F2-mu),构建SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR报告基因载体pMIR-SP1、pMIR-E2F2、pMIR-SP1-mu和pMIR-E2F2-mu。培养HEK-293细胞,采用脂质体法将SP1和E2F2的野生型和突变型pMIR-Luc质粒共转染HEK-293细胞24 h。将细胞分为SP1空白对照组、SP1目标序列组、SP1突变序列组、E2F2空白对照组、E2F2目标序列组、E2F2突变序列组,均加入0.2μg重组质粒、0.01μg对照质粒和0.375μL寡核苷酸,培养24 h。采用双荧光素酶报告基因系统检测双荧光素酶活性,以萤火虫荧光素酶活性值(F)/海肾荧光素酶活性值(R)比值评价miR-155与SP1及E2F2 mRNA 3′-UTR结合效果。结果在线预测结果示,SP1 mRNA 3′-UTR和E2F2 mRNA 3′-UTR均有与miR-155完全互补配对的序列,确定二者均为miR-155的靶基因。经鉴定,SP1和E2F2报告基因重组质粒构建成功。SP1目标序列组F/R低于SP1空白对照组及SP1突变序列组(P均<0.05),E2F2目标序列组F/R低于E2F2空白对照组及E2F2突变序列组(P均<0.05)。结论成功构建了SP1和E2F2报告基因重组质粒,证实miR-155能够靶向结合SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR,在转录后水平抑制SP1和E2F2的表达。
关键词:特异性蛋白1 e2f2转录因子 微小rna155 荧光素酶报告基因 人端粒酶逆转录酶
单位:河北北方学院研究生部; 河北张家口075000; 中国人民解放军第309医院
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