摘要：目的：验证DNA甲基转移酶1（DNMT1）是miR-148a直接调控的靶基因,探究miR-148a通过靶向DNMT1调控骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌分化的作用机制。方法：MSCs细胞经5＇-氮胞苷（5＇-aza）诱导向心肌分化后,使用miRNA芯片筛选出诱导前后表达差异的miRNAs。Targetscan软件分析异常表达的miR-148a的靶基因,将野生型或突变型DNMT1的3＇-UTR区域克隆到荧光素酶报告基因的下游（DNMT1-wt或DNMT1-mut）并分别与miR-148a mimics（miR-148a模拟物）或scramble（miR-148a阴性对照）共转染,荧光素酶报告基因实验验证所预测的靶基因DNMT1,qRT-PCR和Western blot分别检测转染miR-638 mimics和scramble后,对DNMT1的mRNA和蛋白表达的影响。构建miR-148a慢病毒质粒,分别在转染到MSCs后的第1、7、14和28天后检测miR-148a对GATA结合因子4（Gata-4）基因上游DNA调控序列CpG甲基化水平的影响、qRT-PCR和Western blot分别检测转染miR-148a慢病毒质粒后对心肌特异蛋白：球蛋白重链（MHC）和心脏肌钙蛋白T（cTnT）、MSCs分化特征蛋白CD90和CD29表达的影响,以及对心肌特异转录因子心脏特异性同源盒基因（Nkx2.5）和Gata-4表达的影响。结果：miRNA芯片筛选5＇-aza诱导MSCs向心肌分化后表达异常的miRNAs,包括miR-146a-5p、miR-148a、miR-539等,其中miR-148a表达明显上调。Targetscan、荧光素酶报告基因实验和qRT-PCR验证DNMT1是miR-148a直接调控的靶基因。miR-148a慢病毒感染MSCs细胞,证实在转染的不同时间,Gata-4上游基因甲基化水平发生改变,且随着转染时间延长,Gata-4甲基化水平呈不断降低趋势,MSCs细胞内MHC和c Tn T表达提高,CD90和CD29表达降低,Nkx2.5和Gata-4表达提高,MSCs细胞出现向心肌分化。结论：miR-148a可通过靶向调控DNMT1而调控MSCs细胞的向心肌分化。

关键词：dnmt1 骨髓间充质干细胞 向心肌分化 

单位：重庆医科大学附属永川医院儿科; 重庆402160