摘要：【目的】对大肠杆菌AcrAB外排泵系统acrA、acrB基因进行原核表达,获得的表达产物AcrA、AcrB蛋白分别免疫兔,制备相应的抗体,建立大肠杆菌外排泵表达水平的ELISA检测方法。【方法】扩增AcrAB外排泵系统acrA、acrB基因片段,扩增片段分别与原核表达载体pET-41a（＋）连接构建重组质粒,于BL21（DE3）中进行诱导表达。表达产物AcrA、AcrB纯化后分别免疫新西兰大白兔,获得抗AcrA、AcrB抗血清,并用Western blot方法对表达产物进行鉴定分析。纯化的AcrA、AcrB蛋白分别按不同的浓度包被酶标板,与不同稀释倍数的抗血清反应,通过ELISA检测确定最佳抗原包被浓度及抗体稀释度,初步建立大肠杆菌外排泵表达水平的ELISA检测方法。【结果】成功克隆和表达了acrA、acrB基因片段,经SDS-PAGE检测表明两种表达产物AcrA、AcrB均以可溶性蛋白形式存在。AcrA、AcrB抗原蛋白最佳包被浓度分别为1.0μg.ml-1和0.5μg.ml-1,抗AcrA、AcrB血清的最佳稀释度分别为1：800和1：400。用初步建立的ELISA方法检测8株大肠杆菌多重耐药菌株外排泵表达水平,结果表明分别用两种蛋白作包被抗体检测外排泵表达水平的结果一致。【结论】本研究通过原核表达的方法获得大肠杆菌AcrAB外排泵系统AcrA、AcrB蛋白并制备了相应的抗体,分别用两种抗体包被酶标板,并建立了大肠杆菌外排泵表达水平的ELISA检测方法,对8株多重耐药菌株的检测结果表明该方法可行、可靠。

关键词：大肠杆菌 外排泵 原核表达 抗体 elisa方法 

单位：华南农业大学兽医学院 广州510642 广东省农业科学院兽医研究所 广州510640