摘要：【目的】搞清苹果茎痘病毒在梨树组织中的分布,为茎尖脱毒提供直接的理论依据和技术支撑。【方法】以库尔勒香梨茎尖、叶片为材料,利用非放射性标记物地高辛（DIG）,通过RT-PCR反应体系,合成了苹果茎痘病毒的cDNA探针,利用核酸探针斑点杂交检测方法对该探针特异性及灵敏度进行验证。研究制作了适合原位PCR及原位杂交的石蜡切片,利用原位反转录酶聚合酶链式反应（IS-RT-PCR）技术检测石蜡切片组织中苹果茎痘病毒RNA的定位及分布,并对影响实验结果的重要因素进行优化。【结果】梨树中的苹果茎痘病毒RNA阳性信号主要位于叶片的叶肉细胞、茎尖的皮层组织及相应的初生维管束。蛋白酶K消化时间以20 min为宜,要获得良好的扩增效果,RT反应体系中RNasin的量需大于0.2 U.μl^-1,dNTPs大于0.4 mmol.L^-1,SuperScriptⅡ在0.1～1.3 U.μl^-1,引物在0.9μmol.L^-1以上。PCR反应体系中适宜的退火温度为60℃,循环35次,引物浓度应在0.8～1.2μmol.L^-1,LA Taq酶浓度大于0.5 U.100.μl^-1。【结论】梨树茎尖顶端分生组织0.25 mm的区域为无病毒区域。

关键词：库尔勒香梨 苹果茎痘病毒 cdna探针 地高辛 原位pcr 

单位：石河子大学农学院园艺系 新疆石河子832003