摘要：【目的】通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法，拯救出毒力减弱的轮状病毒（rotavirkls，RV）。【方法】以野生型轮状病毒CHLY基因组RNA为模板，通过重叠PCR方法在NSP4基因93-104nt引入5个沉默突变核苷酸，并将毒力位点区135aa、136aa和138aa对应的核苷酸进行定向突变，构建了含有突变位点的转录质粒ApT7-NSP4／89／M。将该质粒与携带RNA聚合酶基因的重组质粒pcDNA3．1／T7-RNAP共转染已接种野生型RV病毒的MAl04细胞单层，继续培养24h，获得了携带NSP4变异基因的RV病毒粒子和野生型RV病毒粒子的混合病毒。将获得的混合病毒接种MA104细胞，通过RNA干扰和蚀斑克隆方法逐步筛选纯化以获得拯救Rv。【结果】成功拯救出了NSP4基因变异的RV，该病毒在MA104细胞上的病交和致乳鼠腹泻效果较野生型RV明显减弱。【结论】通过反向遗传技术结合RNAi筛选和蚀斑克隆方法成功拯救出毒力减弱的Jig；NSP4毒力位点135aa、136aa和138aa的变异对RV毒力改变和腹泻严重程度有影响。

关键词：轮状病毒 反向遗传技术 nsp4基因 

单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所 山东省动物疫病防治与繁育重点试验室 济南250100 山东省农业科学院奶牛研究中心 济南250100