摘要：【目的】人凝血因子IX（human coagulation factor IX，hFIX）是凝血过程中的关键因子，对临床治疗血友病有着极其重要的意义。研究旨在构建人凝血因子IX乳腺表达载体，在猪乳腺上皮细胞中验证其乳腺特异表达能力，获得hFIX转基因雌性乳腺上皮细胞和猪胎儿成纤维细胞，为克隆乳腺特异表达人凝血因子IX的转基因猪做准备。【方法】按照TaKaRa公司RNAiso Reagent和Prime Script RT—PCR试剂盒的说明书，从人胎儿肝脏中提取RNA并扩增出入凝血因子Ix（humancoagulation factorIX，hFIX）cDNA序列，利用PCR方法扩增牛生长激素（BGH）polyA序列，将hFIX的cDNA序列与BGHpolyA序列分别连接到表达载体pbCSN2-Rc的牛酪蛋白（CSN2）启动子之后，构建带有新霉素抗性和红色荧光蛋白双筛选标记的乳腺特异性表达载体pbcsN2-hFIx—pA—Rc。取本地屠宰的泌乳期猪乳房组织，利用组织块种植法培养猪乳腺细胞，并通过控时消化分离纯化猪乳腺上皮细胞，进行染色体分析后，挑选含有正常染色体数目的细胞，通过脂质体法将表达载体导入，经过G418筛选获得稳定表达红色荧光蛋白的转基因细胞，反转录、实时定量PCR验证乳腺表达载体构建的合理性和有效性。为了只对雌性胎儿成纤维细胞进行转基因操作，首先对培养的猪胎儿成纤维细胞进行SRY基因PCR扩增，确定其性别。之后，利用脂质体将证明有效的表达载体导入细胞，并进行G418和红色荧光蛋白表达筛选，对经过鉴定的阳性细胞进行扩大培养和冷冻保存，为下一步的体细胞克隆做准备。【结果】经PCR和酶切鉴定，人凝血因子IXcDNA和BGHPoIyA成功克隆到载体pbCSN2-RC中，获得具有双筛选标记的pbCSN2-hFIX—pA—Rc。转染后G418和红色荧光蛋白表达阳性的猪乳腺上皮细胞，经实时定量PCR鉴定，hFIX有高效表达，证明所构建载体具有指导人FIX在乳腺特异�

关键词：人凝血因子ix 乳腺特异性表达载体 猪乳腺上皮细胞 猪胎儿成纤维细胞 转染 

单位：内蒙古大学哺乳动物生殖生物学及生物技术教育部重点实验室 呼和浩特010021