摘要：【目的】确定类猪圆环病毒P1存在开放阅读框ORF2和ORF3;【方法】采用Trizol法,提取类猪圆环病毒P1分子克隆转染PK-15细胞的总RNA,纯化之后,分别用P1 ORF2和ORF3特异性引物进行RT-PCR,应用AxyPrepTM DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物,转化Trans5α感受态细胞,挑取单菌落,经PCR检测为阳性后测序。同时,利用rapid-amplification of cDNA ends（RACE）技术分别扩增P1病毒ORF2和ORF3的5′-与3′-末端。另外,根据P1 ORF2和ORF3的序列预测其B细胞抗原表位,采用标准的逐步固相合成法合成表位肽,与载体蛋白KLH偶联后,免疫新西兰大白兔制备抗P1 ORF2和ORF3的多克隆抗体。采用常规间接ELISA法检测分离血清效价,包被抗原用合成肽,450 nm波长下测定,血清抗体效价为S/N≥2.1的血清最高稀释度。然后,用P1双拷贝分子克隆转染PK-15细胞,通过免疫组化方法对该多抗与P1的反应性进行检测,同时利用实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中P1的拷贝数。【结果】利用ORF2和ORF3特异性引物对P1 RNA进行的RT-PCR,均能扩增出目的片段,回收测序大小分别为111 bp和128 bp,分别与P1 ORF2和ORF3进行同源性比较,序列同源性均为100%;RACE技术分析,得到P1 ORF2的5′-和3′-RACE末端分别为第11位（G）和第168位（T）,P1 ORF3的5′-和3′-RACE末端分别为第285位（T）和第579位（A）。根据预测结果,合成肽的氨基酸序列分别为ORF2：CLSRLPQSERPPGRW和ORF3：CVYPKVRERRVLKMP;用ORF2和ORF3表位肽与载体蛋白KLH的偶联物免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体效价均达到1﹕512 000以上,并且能够与P1病毒发生特异性显色反应,应用蓝色DAB显色试剂盒染色结果为紫蓝色,多数在细胞浆,少数在细胞核,而对照组细胞无显色反应。定量PCR检测结果显示,P1可以在转染P1双拷贝分子克隆的PK-15细胞中复制,并且转染后104 h增殖量达最大。【结论】通过转录分析和免疫组化试验分别从转�

关键词：p1 orf2 orf3 race 免疫组化 

单位：南京农业大学动物医学院 南京210095 江苏省农业科学院兽医研究所/农业部兽用生物制品工程技术重点实验室/国家兽用生物制品工程技术研究中心 南京210014