摘要：[目的]利用反向遗传学方法构建苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中表达GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1的敲除载体，通过同源重组的方法进行基因敲除分析目标基因的功能，为全面解析苹果树腐烂病菌致病的分子机制奠定基础，并为有效控制苹果树腐烂病的方法技术和药剂研制提供理论依据。[方法]通过对笔者实验室苹果树腐烂病菌转录组数据的分析比对得到GTP-环化水解酶II基因Vmgtp1（暂命名），该基因在接种5 d后，在病组织中表现出一定的上调表达，推测该基因可能与苹果树腐烂病菌致病相关。采用Double-joint PCR方法，将目标基因Vmgtp1的上游片段UP、下游片段DOWN及筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因（hph）进行片段融合。对得到的PCR产物及质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS进行双酶切，通过T4连接酶，将片段UP-HPH-DOWN连接到质粒pHIG2RHPH2-GFP-GUS上，转化到JM109菌株中，挑取阳性克隆，提取质粒，得到含有hph的Vmgtp1敲除载体，再利用PEG介导的遗传转化获得抗潮霉素的突变体，然后用4对引物对突变体进行PCR检测及Southern Blot验证得到敲除突变体，最后对敲除突变体及野生型菌株03-8进行菌落颜色、菌落大小、繁殖体产生情况等表型分析和接种在离体苹果烫伤枝条上观察病斑大小的致病性检测，对检测数据用SPSS软件进行差异显著性分析。[结果]通过上述方法成功构建了表达GTP-环化水解酶II基因的Vmgtp1敲除载体，并利用PEG介导的遗传转化方法在苹果树腐烂病菌中进行了转化，共获得101个能够在含潮霉素PDA培养基上生长的突变菌株，经过PCR及Southern Blot对101个突变菌株进行分析验证，得到1个敲除突变体，编号为ΔVmgtp1-90。在PDA培养基上，敲除突变体ΔVmgtp1-90与野生型菌株03-8相比，ΔVmgtp1-90菌落平均生长速率为11.33 mm·d-1，03-8平均生长速率为24.67 mm·d-1，突变体菌落生长速率明�

关键词：苹果黑腐皮壳 同源重组 peg 致病性 

单位：西北农林科技大学植物保护学院、旱区作物逆境生物学国家重点实验室 陕西杨凌712100