摘要：【目的】预测和验证羊驼 TGF-β1是 miR-663的靶基因之一，并对 miR-663介导的 TGF-β1在黑色素生成过程中的作用进行研究。【方法】利用 Targetscan、RNAhybrid 和 RNA22在线预测 miR-663的靶基因，并对靶基因3′UTR 区可能的 miR-663的作用位点进行分析。利用 DNAMAN 软件分析比对羊驼、人和牛等哺乳动物 TGF-β1-3′UTR 区的相似性。利用 SacⅠ和 XbaⅠ将羊驼 TGF-β1基因的3′UTR 区插入 pmirGLO 构建双荧光报告载体 pmirGLO-TGF-β1-3′UTR 并与 miR-663 mimic 共转染293T 细胞，通过测定荧光素酶活性来验证 miR-663的直接靶基因是 TGF-β1。在羊驼黑色素细胞中通过转染 miR-663 mimic 来过表达 miR-663，并利用 qRT-PCR 和 Western blotting 检测 miR-663过表达后细胞中 TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7和β-catenin 分别在 mRNA 和蛋白水平的变化及黑色素含量的变化。【结果】软件预测显示 miR-663有68个保守的靶基因，包含74个保守的靶位点和44个非保守靶位点。TGF-β1是 miR-663的靶基因之一，且已被证明与毛囊发育和黑色素生成相关。不同物种的 TGF-β1基因的3′UTR 区相似性较高且均存在多个保守的 miR-663靶位点。克隆了羊驼 TGF-β1基因3′UTR 区发现存在3个保守的 miR-663靶位点。成功构建包含3个 miR-663作用位点的 pmirGLO-TGF-β1-3′UTR 双荧光报告载体并与 miR-663 mimic 共转染293T 细胞。双荧光素酶报告基因检测结果显示：与对照组相比，试验组 pmirGLO-TGF-β1-3′UTR ＋ miR-663 mimic 荧光素酶活性下调31.01%，表明 TGF-β1是 miR-663直接的靶基因。在羊驼黑色素细胞中转染 miR-663 mimic 后：miR-663表达量上调334倍，TGF-β1、β-catenin、Smad4基因的表达量分别下调89%、41%、34%；TGF-β1蛋白表达量下降了21%，β-catenin 蛋白表达量无明显差异；黑色素细胞中的黑色素含量下降42%。【结论】TGF-β1是 miR-663的直接靶基因。miR-663通过调控 TGF-β1的�

关键词：羊驼黑色素细胞 双荧光素酶报告载体 黑色素 

单位：山西农业大学生命科学学院 山西太谷030801 山西农业大学动物科技学院 山西太谷030801