摘要：【目的】转座子（transposon,Tn）是染色体上可自主复制和移位的基本单位,普遍存在生物体基因组内,Sleeping beauty（SB）、piggy Bac（PB）和Tol2分别来源于鲑鱼、甘蓝尺蠖蛾和青鳉鱼,是目前脊椎动物中活性较高的转座子。比较了这3种转座子在哺乳动物细胞的转染、插入和剪切效率,从而获得细胞水平上的高活性转座子系统。【方法】通过高保真PCR法分别从SB、PB和Tol23种转座子载体克隆3种转座子3′和5′端的转座元件,测序正确后,将各转座元件依次亚克隆至p T2-HB载体框架,构建成包含这3种转座子的多转座子载体pT3-PST。将绿色荧光蛋白表达框CAG-GFP和新霉素表达框PGK-NEO分别克隆至p T3-PST载体,获得两个表达载体pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。将这两个表达载体分别和转座酶表达质粒pCMV-SB100X、p CMV-HAhy PBase、p CMV-Tol2以1﹕1质量比混合,经多聚阳离子PEI包裹,共转染小鼠胚胎成纤维细胞（3T3）,同时以突变失活的转座酶质粒SB△DD与转座子载体共转染作为阴性对照组。转染GFP 36 h后,用荧光显微镜进行检测GFP表达率,提取细胞基因组,以Amp基因作为内参,进行实时荧光定量PCR,检测GFP插入拷贝数;根据被剪切位置上下游序列设计引物,进行实时荧光定量PCR,检测3种转座子的剪切效率。细胞转染NEO 48 h后,用浓度为500μg·m L-1的G418进行耐药性筛选,至正常细胞基本全部死亡（10 d）,将细胞进行吉姆萨染液染色,统计耐药细胞数,从而比较各组转座活性。【结果】成功构建了多转座子载体PT3-PST、pT3-PST-CAG-GFP和pT3-PGK-NEO。实验组转染细胞效率均大于50%,且差异不显著（P〉0.05）。SB组GFP相对拷贝数高于Tol2和PB组,但差异不显著（P〉0.05）,均显著高于对照组（P〈0.05）。SB和PB组剪切效率显著高于Tol2组（P〈0.05）,但SB和PB组之间差异不显著（P〉0.05）。pT3-PGK-NEO与转座酶共转染3T3细胞,G418抗性�

关键词：sb转座子 pb转座子 tol2转座子 胚胎成纤维细胞 转座活性 

单位：扬州大学动物科学与技术学院 江苏扬州225009