摘要：【目的】利用分离泛素酵母双杂交膜系统（split-ubiquitin yeast membrane system）,以小麦矮缩病毒（Wheat dwarf virus,WDV）的外壳蛋白（CP）基因为诱饵对异沙叶蝉（Psammotettix alienus L.）c DNA文库进行筛选,研究异沙叶蝉传播WDV的分子机制。【方法】以笔者实验室饲养的异沙叶蝉为材料,提取其总RNA后取100 ng进行纯化,利用SMART法反转录合成ds c DNA,经过Sfi I酶切纯化,连接到p PR3-N文库载体上,构建得到以p PR3-N为载体的异沙叶蝉分离泛素酵母双杂交膜系统c DNA文库。同时,构建带有Sfi I酶切位点的诱饵载体p DHB1-WDV CP,经功能检测后用诱饵载体初步筛选p PR3-N空文库,寻找适合筛库的条件和确定His基因产物抑制剂3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）的使用浓度。然后用诱饵载体筛选异沙叶蝉c DNA文库,对筛选结果进行分析,再通过共转验证和β-半乳糖苷酶检测进一步验证是否发生互作。利用Uniprot和KEGG在线网站,对筛到的蛋白进行gene ontology（GO）注释和Pathway分析。【结果】初级文库库容量超过2.0×106 cfu,文库实际扩增数量大于1.3×106 cfu,文库重组率大于97%,扩增文库插入片段平均长度大于1 000 bp,表明异沙叶蝉c DNA文库的质量较高。酶切验证显示诱饵载体p DHB1-WDV-CP中CP的插入完整而准确。功能检测表明融合蛋白能够正确表达。在3-AT浓度为5 mmol？L-1的筛选条件下,诱饵载体筛选异沙叶蝉c DNA文库得到280个克隆,经测序和Blast比对分析最终得到12个可能与WDV的CP发生互作的异沙叶蝉蛋白质。将这12个蛋白质再次进行共转验证和β-半乳糖苷酶检测,最终得到9个蛋白质与WDV CP互作。GO注释显示,9个蛋白参与的生物过程包括蛋白去磷酸化、碳水化合物代谢过程、先天性免疫应答、模式识别受体的信号通路、运输、同向运输和乙醇氧化等;分子功能包括金属离子结合活性、蛋白磷酸酶活性、信号模式识别

关键词：异沙叶蝉 小麦矮缩病毒 smart技术 cdna文库 分离泛素酵母双杂膜系统 

单位：中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室 北京100193