摘要：【目的】建立一种快速、灵敏的检测蜜蜂球囊菌（Ascosphaera apis）的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法,为监测和防治蜜蜂白垩病提供技术支撑。[方法]根据蜜蜂球囊菌特异性序列ITS区,用在线引物设计软件PrimerExplorer V4.0设计并合成4条特异性引物A.apis-F3（5＇-ACATTGCGCCCTCTGGTA-3＇、A.apis-B3（5＇-TGGTTAGACCGGACAGTCG-3＇、A.apis-FIP（5＇-TAAGACGGGACGATCGCCC AACCTGTCCGAGCGTCATTG-3＇）和A.apis-BIP（5＇-GAAAGGCAGTGACGGCGTCGGGCCACTAGAGCGAAAGAC-3＇）,进行LAMP扩增试验,分别设置Mg^2＋终浓度为0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L^-1,dNPTs终浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^-1,内引物FIB/BIF终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^-1,甜菜碱终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mo1·L-1,反应温度为58、60、63、65℃,反应时间分别为30、40、50、60 min,并利用实时浊度仪测定浊度值和扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳来检测LAMP反应的结果,确定优化的LAMP检测体系。以东方蜜蜂微孢子虫（Nosema ceranae、蜜蜂微孢子虫（Nosema apis、蜜蜂残翅病毒（Deformed wing virus,DWV、蜜蜂囊状幼虫病毒（Sacbrood virus,SBV、黑蜂王台病毒（Black queen cell virus,BQCV）和以色列急性麻痹病毒（Israel acute paralysis virus,IAPV）基因组为模板进行特异性验证。并用PvuⅠ酶切验证产物,最终确定LAMP反应体系的准确性;进而通过将蜜蜂球囊菌基因组DNA进行10倍梯度稀释,分别获得DNA浓度0.2231、0.2231×10^-1、0.2231×10^-2、0.2231×10^-3、0.2231×10^-4、02231×10^-5、0.2231×10^-6、0.2231×10^-7、0.2231×10^-8）μg·μL^-1作为模板,比较LAMP和普通PCR检测灵敏度,并检测验证该技术在临床应用上的可行性。【结果】建立了一种特异检测蜜蜂球囊菌的方法,反应条件优化后的检测体系为4 mmol·L^-1Mg~（2＋、1.2 mmol·L^-1dNTPs、1.6

关键词：环介导等温扩增 蜜蜂球囊菌 快速检测 实时浊度 

单位：福建农林大学蜂学学院 福州350002