摘要：【目的】牛支原体（Mycoplasma bovis）是导致牛多种疾病综合征的病原体之一,在世界范围广泛流行。为了有效监测此病在中国的流行情况,迫切需要敏感、便捷的诊断试剂产品。【方法】通过构建含有牛支原体uvrC基因片段的重组质粒并转化TOP10感受态细胞,获得重组大肠杆菌rP-uvrC。重组大肠杆菌大量表达并提取重组质粒后,获得质粒浓度为10^4拷贝/μL的溶液,作为质控用阳性对照品。根据文献报道的浓度配制甜菜碱溶液和显色液（主成份为SYBR Green I和HNB）,分别作为冻干品溶解用溶液和等温扩增产物显色溶液。在已建立的牛支原体环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测技术的基础上配制等温扩增试剂,并通过考察等温扩增反应情况在常用的8种冻干疫苗耐热保护剂中选择对等温扩增反应没有影响的3种冻干保护剂,每种保护剂分别选用3种不同的浓度,共设计27种保护剂组方,通过观察冻干品物理性状选择最佳的一组保护剂配制冻干用等温扩增试剂,放到冻干机中测定共晶点,并优化一次干燥升温时间、干燥时间和二次干燥时间。通过对冻干制品物理性状的检验、真空度的检测以及残余水分含量的测定,筛选出一条适合等温扩增试剂的冻干曲线,并以此制备等温扩增试剂冻干品。取一定量等温扩增试剂冻干品、甜菜碱溶液、阳性对照品溶液和显色液,组装成试剂盒。利用6个浓度梯度（10^0-10^5个拷贝）重组质粒溶液检测试剂盒的敏感性,利用浓度为10^4 CCU·mL^-1的PG-45株、HB-1株、SD-2株牛支原体菌液、10^8CCU·mL^-1的牛鼻支原体和无乳支原体菌液、10^8CFU·mL^-1的多杀性巴氏杆菌和结核分枝杆菌,检测试剂盒的特异性。另外,将等温扩增冻干试剂盒分别置于不同温度下保存,检测其稳定性。【结果】8种冻干保护剂中只有海藻糖、甘露醇和牛血清白蛋�

关键词：牛支原体 等温扩增 冻干 试剂盒 

单位：南京农业大学生命科学学院; 南京210095; 中国农业大学动物医学院; 北京100193