摘要：【目的】建立一种灵敏、快捷的检测蝗虫微孢子虫（Paranosema locustae）的套式PCR方法,为运用微孢子虫防治蝗虫提供技术支持。【方法】以GenBank数据库中公布的保守性高的微孢子虫小核糖体亚单位RNA为目的基因,采用PrimerSelect软件设计两对特异的套式PCR引物P.L.-F1/P.L.-R1和P.L.-F2/P.L.-R2,将微孢子虫液用0.2 mol·L^-1 KOH处理后得到的发芽液作为模板进行PCR扩增,建立以P.L.-F1/P.L.-R1为外侧引物、P.L.-F2/P.L.-R2为内侧引物的套式PCR,扩增产为分别为298和242 bp。对引物浓度、退火温度及循环数进行优化,建立套式PCR方法,以此方法对梯度稀释的微孢子虫液进行灵敏性检测,并对采自哈密地区巴里坤北山的蝗虫样品进行检测。同时对提取的微孢子虫液进行传统的显微镜检测,并比较两种方法的灵敏度。【结果】建立了蝗虫微孢子虫的套式PCR快速特异性检测方法,优化后的PCR反应体系均为20μL：Buffer（10×）2.0μL,d NTPs（10 mmol·L^-1）0.3μL,TaqDNA酶（250 U）0.3μL,上、下游引物（10μmol·L^-1）各0.3μL,微孢子虫发芽液（第2轮以第1轮产物10×稀释液为模板）1μL,加水补充至20μL;PCR反应程序为：94℃预变性3 min;94℃变性30 s,第1轮60℃退火（第2轮62℃退火）30 s,72℃延伸20 s,共35个循环;72℃延伸10 min,10℃保存。灵敏度试验显示,检测的微孢子虫数量可以达到12.2个孢子/μL（DNA量为1.07 pg·μL^-1）。应用建立的套式PCR方法,对采自新疆哈密地区巴里坤北山的240头蝗虫样品进行了微孢子虫检测,检测结果为23.3%的阳性,而显微镜检测结果阳性仅为3.8%。【结论】研究建立的套式PCR方法能够快速特异地检测蝗虫微孢子虫的感染,为蝗虫微孢子虫致病性研究及田间应用提供了技术支持。

关键词：蝗虫微孢子虫 套式pcr 检测 

单位：新疆师范大学生命科学学院/新疆特殊环境物种多样性应用与调控实验室/中亚区域跨境有害生物联合控制国际研究中心; 乌鲁木齐830054; 新疆哈密地区蝗虫鼠害预测预报防治站; 新疆哈密839000; 新疆维吾尔自治区蝗虫鼠害预测预报防治中心站; 乌鲁木齐830046