摘要：【目的】小眼畸形相关转录因子-M型（microphthalmia associated transcription factor M,MITF-M）在动物皮肤和毛发的黑色素合成途径中发挥重要作用,克隆绵羊小眼畸形相关转录因子-M型基因序列,研究在绵羊黑素细胞中过表达绵羊MITF-M是否影响TYR、TYRP-1和TYRP-2的表达,从而探究对黑色素的生成的影响。【方法】使用试验室冻存的第5代绵羊黑素细胞,通过PCR方法用引物以绵羊黑素细胞cDNA为模板克隆MITF-M基因cDNA序列,构建绵羊MITF-M克隆载体和真核表达载体;通过细胞转染技术在细胞水平过量表达绵羊MITF-M;转染后使用荧光显微镜观察细胞转染效率,采用分光光度计对绵羊黑素细胞中黑色素含量进行测定,并进行Real-time PCR试验检测转染后细胞MITF、TYR、TYRP-1和TYRP-2基因在mRNA水平表达量的变化,Western blot试验检测转染后细胞MITF、TYR蛋白水平的变化。【结果】经测序和拼接,最终获得长度为1 242 bp的绵羊MITF-M基因的cDNA序列;成功构建真核表达载体,载体上连有一个启动报告基因绿色荧光蛋白和特异性TYRP-2基因启动子;细胞转染后,在荧光显微镜下可观察到黑素细胞带有绿色荧光说明转染效率明显;分光光度计检测显示,转染后绵羊黑素细胞中黑色素量增加1.15倍（P〈0.05）;荧光定量检测结果显示,绵羊黑素细胞中MITF mRNA表达量增加极显著（P〈0.001）,表明绵羊MITF-M转染效率显著,TYR mRNA表达量增加极显著（P〈0.001）,TYRP-1 mRNA表达量升高至5.06倍（P〈0.05）,TYRP-2 mRNA表达量升高至1.49倍,变化不明显。蛋白免疫印迹结果显示,绵羊黑素细胞中MITF-M转染组MITF蛋白表达量是空载体组的1.65倍（P〈0.001）,转染组TYR蛋白表达量是空载体组的2.38倍（P〈0.001）,这与荧光定量检测结果一致。【结论】通过PCR和克隆技术及核酸测序技术获得了绵羊MITF-M基因全长1 242 bp的CDS区,过表达绵羊MITF-M会使黑素细�

关键词：tyr 

单位：山西农业大学动物科技学院; 山西太谷030801; 山西医科大学晋祠学院; 太原030025; 山西医科大学基础医学院; 太原030001