摘要：【目的】建立一种利用反转录环介导等温扩增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP）技术简便、快速检测苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV）的方法。【方法】在ACLSV基因组序列的3个保守区域设计3组引物,每组引物包括一对外引物（F3/B3）和一对内引物（FIP/BIP）,从3组引物中筛选出一组效果最好的引物。对RT-LAMP反应体系,即Mg^2＋、d NTPs、Betaine、FIP/BIP、B3/F3浓度进行优化,Mg^2＋浓度梯度设置为0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0 mmol·L^-1,d NTPs浓度为0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol·L^-1,Betaine浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol·L^-1,FIP/BIP浓度为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4μmol·L^-1,F3/B3浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4μmol·L^-1;优化RT-LAMP反应条件,采用已优化的反应体系,设置65、63、61、59、57℃5个不同的反应温度,反应时间设定为90 min。在引物筛选和反应体系反应条件优化过程中,使用荧光定量PCR仪,在反应体系中加入荧光染料,利用荧光信号积累实时监测整个反应过程,根据扩增曲线判断反应结果。以携带苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus,ASGV）、苹果茎痘病毒（Apple stem pitting virus,ASPV）、苹果花叶病毒（Apple mosaic virus,Ap MV）的植株叶片中提取的总RNA为模板测试RT-LAMP检测方法的特异性。将含ACLSV的叶片总RNA原液进行10倍梯度稀释,以RNA原液和10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释液作为模板,进行RT-LAMP反应,测试RT-LAMP检测方法的灵敏性。随机采集23株苹果树的叶片,同时进行RT-LAMP和RT-PCR检测,加入SYBR GreenⅠ进行可视化检测。【结果】建立了ACLSV RT-LAMP检测方法,优化的检测体系为：6.0 mmol·L^-1 Mg^2＋、1.2 mmol·L^-1 d NTPs、0.2 mol·L^-1 Betaine、1.6μmol·L^-1 FIP/BIP和0.2μmol·L^-1 F3/B3引物,最佳反应条件为59℃,60 min。特异性检测中,仅ACLSV检测结果为阳

关键词：苹果 苹果褪绿叶斑病毒 反转录环介导等温扩增 pcr 病毒检测 

单位：中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心; 辽宁兴城125100