摘要：【目的】获得产气荚膜梭菌ε毒素（ETX）的无毒重组突变体,并评价其毒力及免疫原性。【方法】对已知的D型产气荚膜梭菌ETX编码基因按照大肠杆菌偏爱密码子进行优化设计。同时,将第106位的组氨酸和第199位的苯丙氨酸分别突变为脯氨酸和谷氨酸,经人工合成,获得基因片段GETXm2。将GETXm2克隆至原核表达载体p ET30a-（＋）后,将p ET30a-GETXm2转化至BL21（DE3）感受态细胞中,在15℃和37℃两种条件下分别用IPTG诱导16 h和4 h,超声破碎后收集上清和沉淀,采用SDS-PAGE和Western blot方法检测重组蛋白的表达情况及其可溶性。利用Ni-IDA亲和层析方法对可溶性表达的重组蛋白进行纯化,从而获得重组蛋白r ETXm2。利用Western blot方法,检测r ETXm2与D型产气荚膜梭菌ETX抗血清的反应性。将r ETXm2用细胞维持液稀释至100及10μg·m L-1,检测其对犬肾细胞系（MDCK细胞）的毒力。分别用胰酶活化前和活化后的r ETXm2,以0.0625、0.625和6.25 mg·kg-1 3个剂量尾静脉注射,检测r ETXm2对小鼠的毒力。随后,将r ETXm2与Montanide ISA 201佐剂混合乳化制备疫苗,取4只健康家兔,皮下免疫2次（间隔两周）,100μg/只。同时,Montanide ISA 201佐剂与PBS混合液免疫组作为对照组。分别在一免后14 d以及二免后21 d,采血,分离血清,按照《中华人民共和国兽药典》（2015年版）规定的方法检测血清对D型产气荚膜梭菌毒素的中和抗体效价。同时,在二免后21 d,对家兔经耳缘静脉注射1个家兔MLD的D型产气荚膜梭菌毒素,检测r ETXm2对家兔的免疫保护效果。【结果】在15℃和37℃条件,r ETXm2在BL21（DE3）菌体中均以可溶性和包涵体两种形式表达,综合考虑重组蛋白的表达量、可溶性及诱导时间,选择纯化在37℃条件下诱导获得的可溶性r ETXm2。灰度扫描结果显示,在37℃诱导条件下,r ETXm2可溶表达比例达30%;Western blot检测结果表明,D型产气荚膜梭菌�

关键词：突变 重组表达 毒力 抗原性 

单位：中国兽医药品监察所牛羊病实验室; 北京100081