摘要：【目的】先选用绿色荧光蛋白基因（egfp）作为试验基因构建loxp位点位于egfp基因上游或下游不同位置的表达结构,对loxp位点的位置对基因表达的影响进行初步分析。然后以植酸酶（phytase）基因为另一个试验基因对通过egfp基因得出的结果进行进一步验证。研究结果为开展通过基因打靶技术将外源基因与内源基因通过2A序列连接共表达的转基因动物制作中,打靶位点的选择提供可靠依据。【方法】先选择增强绿色荧光蛋白基因（egfp）为试验基因,红色荧光蛋白基因（dsred2）为内参基因。以p EGFP-N2、p GEM-5zf-loxp质粒为基础,构建了ploxp-EGFP（loxp序列位于egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区）、p EGFP-loxp（loxp序列位于egfp基因开放阅读框的终止密码子下游的3′非翻译区）、ploxp-EGFP-loxp（egfp基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp序列）。以p EGFP-N2质粒为对照质粒,以p Ds Red2-N1为内参质粒,与所构建的egfp基因各表达质粒共转染PK15细胞,转染24h后在荧光显微镜下观察荧光表达情况,用荧光分析软件Image J进行荧光强度分析并记录荧光强度,进而应用SPSS19.0软件对各转染荧光表达情况进行分析,确定loxp序列的位置对基因表达的影响。为了对以egfp基因为试验基因所得到的结果进行进一步验证,本试验选择植酸酶（phytase基因）基因为试验基因,egfp基因为转染内参基因萤火虫荧光素酶基因（luciferase基因）为表达内参基因。以p IREs NEo、p GEM-5zf-loxp和p T-phytase、p GL4.13[luc2/SV40]质粒为基础。构建了p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase（loxp序列位于phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游的5′非翻译区）、p-SV40-luciferase-CMV-loxp-phytase-loxp（phytase基因开放阅读框的Kozak序列上游5′非翻译区和终止密码子下游3′非翻译区各有一个loxp

关键词：loxp序列 基因表达 2a序列 基因打靶 

单位：河北农业大学动物科技学院; 河北保定071001