摘要：[目的]通过建立适用于拟轮枝镰孢(Fusarium verticillioides)的农杆菌介导遗传转化体系,构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)标记的拟轮枝镰孢 ATMT(Agrobacterium tumefaciens-mediatedtransformation)突变体库,并对突变体库进行筛选分析,为研究拟轮枝镰孢在玉米果穗上的侵染途径和致病的分子机制打下基础。[方法]筛选头孢噻肟钠(cefotaxime sodium,Cefo)和氨苄青霉素钠(ampicillin sodium,Amp)对根癌农杆菌 AGL-1 的抑菌浓度和拟轮枝镰孢对潮霉素 B(hygromycin B)的敏感浓度;以含有绿色荧光蛋白基因(GFP)、潮霉素抗性基因(HPH)的穿梭质粒为载体,通过 ATMT 构建 GFP 标记的拟轮枝镰孢突变体库;利用潮霉素抗性筛选、GFP的特异性引物进行 PCR 检测和荧光显微镜观察,检测分析 T-DNA 插入情况及转化子稳定性;从突变体库中随机挑选 9 个转化子菌株并进行分析,对其产孢量、分生孢子萌发率、致病力等进行测定。[结果]通过农杆菌抑菌试验发现当 Cefo/Amp 的浓度为 150/150 μg·mL^-1时,AGL-1 生长受到抑制;当潮霉素 B 的浓度为 150 μg·mL^-1时,拟轮枝镰孢完全丧失生长能力。利用优化后的 ATMT 转化获得了 2 465 株GFP 标记的拟轮枝镰孢转化子;转化子在不含潮霉素 B 的 PDA 培养基上连续转接 5 代再转到含潮霉素 B 的培养基上仍能正常生长,说明 HPH成功插入野生型基因组且稳定遗传;利用 GFP特异性引物对转化子进行 PCR检测,测序结果显示与 NCBI 中 GFP(登录号:LC420351.1)的同源性为 99.26%,表明 GFP已成功整合到野生型基因组中;转化子菌丝和孢子在荧光显微镜下观察均呈现绿色,而野生型菌株未观察到任何荧光,表明 GFP转移到拟轮枝镰孢野生型菌株基因组中,且能够成功表达。对部分转化子分析发现,与野生型相比转化子 54的产孢量明显增多,约为野生型的 1.9 倍;转化子 24 的分生孢子萌发率在相同时间内明显下�

关键词：玉米 拟轮枝镰孢 atmt 突变体库 绿色荧光蛋白 

单位：河北省农林科学院植物保护研究所/农业部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室/河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心; 河北保定071000