摘要：[目的]微孢子虫是一种细胞内专性寄生的真核生物,几乎能感染所有生物,包括人类。极管作为微孢子虫特有的侵染器官,主要由极管蛋白组成。极管蛋白在微孢子虫侵染宿主与稳定孢子结构中发挥重要作用。本研究通过克隆、表达家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)极管蛋白 2(NbPTP2),分析其在成熟孢子极管上的定位特征,为深入研究极管蛋白的功能打下基础。[方法]克隆家蚕微孢子虫 NbPTP2。利用 Expasy、SignalP 4.1、TMHMM Server V.2.0 和 NetPhos 3.1 Server 等在线软件对 NbPTP2 的序列特征进行分析,包括氨基酸组成、蛋白质理论分子量、等电点、信号肽、跨膜结构域和磷酸化位点。此外,利用 MEGA 7.0 软件构建不同种属微孢子虫极管蛋白 2 的系统进化树。通过克隆 NbPTP2,将其与原核表达载体 pET32a(+)连接,构建 pET32a(+)-NbPTP2 重组表达质粒。将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌 Rosetta 中,IPTG 诱导异源表达,经镍柱亲和层析纯化融合蛋白后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。利用免疫印迹检测 NbPTP2 在成熟孢子中的表达情况,并通过间接免疫荧光试验(IFA)分析 NbPTP2 在家蚕微孢子虫成熟孢子中的定位特征。[结果]成功克隆并获得长为 834 bp 的 NbPTP2基因序列,该蛋白编码 278 个氨基酸残基,理论分子质量为 30.9 kD,等电点为 9.39,无跨膜结构域,N 端存在信号肽,具有潜在的磷酸化修饰位点。系统进化树分析结果显示,家蚕微孢子虫 NbPTP2 与西方蜜蜂微孢子虫NaPTP2、东方蜜蜂微孢子虫 NcPTP2 的亲缘关系最近。Western blot 结果表明,NbPTP2编码的蛋白质在成熟孢子的孢子总蛋白中有表达,分子量大小约为 39 kD。IFA 定位特征分析结果显示,NbPTP2 能定位于家蚕微孢子虫的整条极管上,证实其为一种极管蛋白。[结论]明确了 NbPTP2 与其他微孢子虫极管蛋白 2 的亲缘关系,NbPTP2 在成熟家蚕微孢子虫中有表达,

关键词：家蚕 家蚕微孢子虫 极管蛋白 2 原核表达 

单位：西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室/微孢子虫感染与防控重庆市重点实验室; 重庆400715; 西南大学生物技术学院; 重庆400715