摘要：目的利用RNA干扰技术沉默宫颈癌HeLa细胞中DNA甲基转移酶（DNMT）1基因的表达，探讨沉默DNMT1基因后对HeLa细胞增殖及凋亡的影响。方法针对DNMT1基因构建短发夹状RNA（shRNA）重组载体pshRNA-DNMT1-A、B和C质粒，并行酶切鉴定和测序分析。采用RT-PCR技术筛选出其中RNA干扰效果最佳的重组载体，通过脂质体介导转染宫颈癌HeLa细胞（转染组），以空载体组（转染空载体pSilencer3．1-H1质粒）和未转染组（未作任何处理）为对照。采用RT-PCR技术和蛋白印迹法分别检测转染前后HeLa细胞中DNMT1mRNA和蛋白表达的变化，活细胞计数（CCK-8）法和双染法流式细胞术分别检测转染前后HeLa细胞增殖和凋亡的变化。结果（1）酶切鉴定和测序分析证实，靶向DNMT1的3个shRNA重组载体pshRNA-DNMT1．A、B和C质粒构建成功。RT-PCR技术筛选显示，重组载体pshRNA-DNMT1-B质粒的干扰效果最佳。（2）RT-PCR技术检测显示，转染组转染24、48及72h时HeLa细胞中DNMT1mRNA的相对表达水平分别为0．406±0．057、0．191±0．036、0．104±0．015，明显低于空载体组和未转染组（分别为0．520±0．020、0．537±0．041，P〈0．05）。蛋白印迹法检测显示，转染组转染24、48及72h时细胞中DNMTl蛋白的相对表达水平分别为0．197±0．024、0．075±0．015、0．040±0．013，明显低于空载体组和未转染组（分别为0．273±0．010、0．283±0．016，P〈0．05）。（3）CCK-8法检测显示，转染组转染24、48、72、96、120h时HeLa细胞存活率分别为70．8％、64．8％、51．6％、45．3％、38．0％，分别与空载体组和未转染组各时间点比较，差异均有统计学意义（P〈0．01）。双染法流式细胞术检测显示，转染组转染24、48及72h时的细胞凋亡率分别为（17．7±1．3）％、（35．3±1．3）％、（47．6±1．6）％，明显高于空载体组及未转染组[分别为（4．9±0．5）％、�

关键词：宫颈肿瘤 hela细胞 rna干扰 细胞增殖 细胞凋亡 

单位：郑州大学笫一附属医院妇产科 450052