摘要：目的：为了获得N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶基因表达的两重组菌。方法：以大肠杆菌C600染色体DNA为模板,通过引物设计和PCR扩增,克隆获得编码Neu5Ac醛缩酶基因（nanA）的片段;以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化E.coliBL21（DE3）,然后将nanA基因片段组入到pDR540载体的Ptac启动子下游,所得重组菌E.coliDH5α/pRY3的nanA基因在tac启动子控制下呈组成型表达。结果：DNA序列测定证明,该基因的开放阅读框（open read ing frame,ORF）大小为894 bp,编码298个氨基酸组成的酶蛋白;SDS-PAGE显示,纯化的目的蛋白为33 kD的单一条带。以pET28b构建的nanA基因重组质粒pRY1转化E.coliBL21（DE3）,在得到的转化子E.coliBL21（DE3）/pRY1中,nanA基因受lac启动子控制,无需IPTG或乳糖所诱导。在N-乙酰-D-神经氨酸醛缩酶固定化酶的催化下合成N-乙酰-D-神经氨酸的合成效率为78.3%,结晶回收率为90.2%,总回收率为70.6%。全波长扫描分析表明：本实验室结晶品与Sigma公司商品的全波长扫描图谱有相同的特征。结论：所构建的诱导型产酶菌株E.coliBL21（DE3）/pRY1和组成型表达菌株E.coliDH5α/pRY3都可较多量的产酶。合成的结晶品具有N-乙酰-D-神经氨酸的特征。

关键词：聚合酶链反应 克隆 分子 重组 遗传 

单位：中科院上海植物生理研究所 上海200032 浙江医学高等专科学校 浙江杭州310053 浙江大学医学院 浙江林学院健康管理系 浙江杭州310058