摘要：目的：利用CRISPR／Cas9基因编辑技术构建两种一体化栽体。用于敲除AMLl2细胞系中的微小RNA（microRNA，miR）．101a。方法：设计三条小鼠靶向miR-101a基因的小向导RNA（sgRNA）以及一条靶向绿色荧光蛋白基因的sgRNA，分别构建至一体化载体系统（pENTRY-U6-sgRNA-EFlα-WCas9），并将sgRNAl和sgRNA3构建至一体化载体系统（pENTRY-U6-sgRNA-U6-sgRNA-EFlα-Cas9D10A）。在AMLl2细胞系中转染构建的一体化质粒，72h后用r17核酸内切酶I（1-7EI）检测剪切效率。将pENTRY一体化质粒通过Gateway的方式重组到pAD载体中，再转染293A细胞进行腺病毒包装。在AMLl2细胞系中进行腺病毒感染，72h后检测miR-101a成熟体的表达水平以评估敲除效率。结果：构建的pENTRY一体化质粒经测序鉴定后正确。质粒转染AMLl2细胞系后进行，17EI检测，均发生了明显剪切形成了两条带，表明设计的sgRNA有效果。pENTRY一体化质粒重组到pAD栽体中，经酶切鉴定正确。腺病毒转染AMLl2细胞系后，实时荧光定量PCR检测表明细胞中miR-101a成熟体表达水平较对照组均明显下降（均P〈0．01）。结论：构建了具有较高敲除效率的靶向小鼠miR-101a基因的一体化栽体系统，为后续微小RNA功能研究奠定了技术支撑和实验基础。同时也为其他微小RNA敲除提供了借鉴方法。

关键词：rna编辑 微rnas 小鼠 基因敲除 腺病毒科 

单位：浙江大学医学院附属第一医院消化内科; 浙江杭州310003