摘要：目的构建包含FANCJ野生型(wt)及其突变体N196S蛋白的真核表达载体,并对纯化的野生型蛋白及突变体蛋白进行活性检测。方法从HEK293T中提取RNA,并反转录为cDNA,使用带有3xFlag标签序列的特异性引物通过PCR方法扩增出人FANCJ编码区全长,并克隆到plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体上;突变体N196S利用NEBaseChanger TM引物设计工具,并利用NEB公司的点突变构建试剂盒Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit技术进行操作。重组的FANCJ及突变体N196S表达质粒通过脂质体polyJet转染到HEK293T细胞中进行表达。使用免疫沉淀及竞争洗脱的方法纯化FANCJ及N196S突变体蛋白。利用荧光标记DNA底物的方法检测FANCJ及N196S突变体蛋白的DNA解旋酶活性。结果FANCJwt基因及N196S突变体全长编码序列成功构建到plvx-EF1-MCS-PGK-PURO载体上,蛋白质印迹法(Western blot)及PAGE胶银染方法成功检测到了FANCJwt及N196S突变体蛋白的表达、纯化,荧光标记Oligo DNA底物方法发现FANCJwt与N196S突变体蛋白DNA解旋酶活性存在差异。结论成功构建了FANCJwt及N196S突变体真核表达载体,通过生化实验发现FANCJ及N196S突变体蛋白存在差异的DNA解旋酶活性。

关键词：fancj 突变体 蛋白纯化 活性检测 

单位：苏州卫生职业技术学院苏州检验医学生物技术重点实验室; 215009; 苏州大学附属第一医院血液科; 苏州215006