关键词：医药物理学课程 问题 改革 教学内容 教学方式 考核检验
一、医药物理学课程教学方法改革的必要性
近年来随着中国经济的迅猛发展，对于医药行业的人才需求与日俱增，但随着社会竞争的日益激烈，对从业人员的要求也越来越高，培养出具有良好专业素质和自主创新能力的毕业生是医学院校人才培养的目标，要做到与经济发展接轨，与产业发展同步，高校教育的相关课程的一定要遵循科学性、系统性、先进性、发展性、平衡性和适用性原则，对课程教学的改革也势在必行。
物理学在现代医药行业的发展中起到了积极的推动作用，医药物理学作为中医院校高等教育中的一门传统基础课程，在培养学生严肃认真的科学作风和逻辑思维能力、分析计算能力、实验技能能力、总结归纳能力等方面应起到重要作用。通过本课程的教学和实验技能的训练，可以使学生掌握本专业所必须具备的物理学的基本概念、基本规律和基本方法，训练基本的实验技能，为学习物理化学、化学分析、药物分析等后续课程以及从事实际工作和科学研究准备必要的物理基础。
物理课程作为医药类专业的基础课程，一直具有理论性强，概念抽象，公式较多，对于高等数学知识有要求等特点，少数学生由于数学基础不牢固，对该课程的认识不足，重视程度不够，造成入门学习困难，难以抓住学习重点，不清楚哪些理论、公式是重要的，哪些需要熟练记忆和灵活运用。在学习过程中难以建立物理概念之间的纵向和横向联系，使得所学知识点成为整个物理知识体系中的“孤岛”。并且由于传统教学手段的限制，教学方式主要以课堂板书讲授为主，对于某些抽象性内容无法形象生动地展现给学生，使得学生无法进行深入理解，学生的学习积极性和主动性没有充分调动，普遍反应学习较为吃力，难以调动学生兴趣，不及格率和其他课程相比偏高。
针对这些在教学中出现的情况，笔者认为必须开展相应的教学改革实践，需要克服枯燥教材给学生带来的压力，调动学生的学习积极性，培养学生的学习兴趣，在学习过程中注重探研过程和科学思想的锻炼，可以采用“降低难度、加强探索、立足课堂、利用课外”的思路创造新的教学支撑条件，用有效的研究实践手段克服教学中的困难，达到掌握知识、培养能力的目的，促进学生问题意识的培养，探索精神和创新能力的形成，合作意识、交际与表达能力的发展，科研程序与科研方法的锻炼，以及个性与心理健康发展，科学态度与社会责任感培养。
二、教学内容的选择
考虑到物理学课程作为医药学专业的一门重要基础课程，根据教学大纲的要求，规定总学时为80学时，其中理论学时56学时，实验学时24学时。理论课教学内容涵盖流体力学、电磁学、波动学、波动光学以及近代物理学等章节的基本原理和典型的分析计算方法，为后续的物理化学，药物分析等课程打好基础。在理论课所开设的章节中可根据需要设计物理学实验，在教学过程中让学生提高动手能力及设计分析能力，体现物理学是一门实验型学科的特点。
在理论教学和实验教学中应采取不同的引导方式，理论课内容应讲授最核心的知识点，例如流体力学中的泊努利方程，连续性方程；稳恒电流中的含源电路欧姆定律和基尔霍夫方程组；波动光学中的干涉、衍射原理等，对最具有迁移价值的学科基本原理进行阐述，对于物理学基本原理和基本定律在教学中可采用尽量浅显生动的直观讲授，辅以视频，建模等多媒体教学手段，力图让学生清楚地理解复杂的物理现象和相关规律，熟悉相关的定义和专用术语，强化基本概念的理解和记忆；在学生掌握基本理论的基础上选用典型的例题，在课堂上进行深入分析讲解和启发式提问与讨论，深化理论内容的理解，使学生更好地理解物理学研究中的理性精神，另外在具体例题的引入上，鼓励学生从枯燥的理论知识出发，探索物理学知识在医药领域的具体应用，使所学知识能够适用于解决相关医药专业问题，激发学生的学习热情，拓宽学生的知识面，提升创新和动手能力。
在教学过程中一定要将物理知识与医药学领域的应用相结合，让学生了解学科之间的互相影响，转变其认为物理学于医药专业无关的想法。例如讲授流体运动学时，由于教材上所涉及的例题多为工程学上的应用，和医药领域的应用结合度不高，因此笔者在备课过程中通过研究多种医药物理学教材以及在互联网上寻找与医药应用有关的流体运动学实例，在授课时首先向学生提问：研究流体在医药领域有什么作用？引导学生进行思考，将学生注意力集中到课堂上来；然后给学生提出流体运动研究的许多医药应用实例，如人体内部的血液流动，制药行业的药液在管道内的传输，厂房的换气与通风，中药制剂药液里的杂质的分离等等诸多问题都牵涉到流体运动的知识。让学生带着问题去学习物理学规律，使他们了解物理学和医药学专业学科之间的渗透和影响，明确医药物理学在其专业学科中的定位以及物理学知识对医药科技发展所起到的重要促进作用，提高对物理学的学习兴趣。
三、教学方式的改进
针对物理学课程基本原理、公式较多的特点，在教学过程中应避免中学填鸭式的教学模式，在教学中重视理解，力图举一反三，在公式原理的推导过程中要求学生建立在理解相关规律的基础上，不提倡机械记忆原理和公式，充分考虑问题的复杂性和条件的多变性，鼓励提示学生采用不同的方法解决同一问题，引导学生把握物理学科的思维方式和研究方法。
教师应树立“学生为主体，教师为主导”的教学心态，讲解原理、规律时多加设问、对比和思考，向学生提出一些灵活性的问题，引导学生进行思考和讨论，将学生的注意力集中于课堂上来，调动学生的探研问题的积极性。
在教学过程中可借助多媒体教学平台和校园网，在课前对学生布置预习任务，在互联网查找与所上章节知识点和医药领域相关的科技新动态，要求以小组的形式先进行讨论和分析，选择有价值的文献在课堂上给予介绍和推广，特别是现代物理技术在医药学发展中的新应用，比如利用光谱分析药物成分，纳米技术在医药学上的最新应用等，让学生接触到物理学前沿技术在医药领域的应用，使他们在更高的层面上了解这门课程的地位，起到辅助提高教学效果，拓宽学生知识面，培养学生探研精神的目的。
【关键词】药理学；教学方法；改革
药理学是研究药物和机体相互作用规律极其原理的一门学科，是药学类专业大学生的必修的四大药学核心科目之一（另外三门学科分别是药物化学，药剂学，药物分析）。药理学的学科任务是要为阐明药物作用及作用机制、改善药物质量、提高药物疗效、防治不良反应提供理论依据，同时为研究开发新药、发现药物新用途并为探索细胞生理生化及病理过程提供实验资料，其重要性毋庸置疑。
药理学作为药学类专业的基础核心课程[1]，药师、执业药师考试的必考科目，也是出现药品名称最多，种类最齐全的药学课程，学好药理学，识别药名，了解基本用途，可以为学生以后工作和生活带来方便，对构建学生对药物的基本素养至关重要。学习药理学的主要目的是要理解药物有什么作用，为什么有这些作用（作用机制）及如何充分发挥其临床疗效，要理论联系实际了解药物在发挥疗效过程中的因果关系。
1 目前药理学教学存在的问题
药理学课程学习有一点难度，首先他是一门综合课程，需要前提有扎实的人体解剖生理学，生物化学，微生物学等基础知识，同时也要懂一些基本的病理生理学和疾病的基本知识，还需要联系药物化学课程的一些诸如构效知识等；其次药理学章节繁多，药物类别、药名繁多、学术术语多、记忆的知识点多，是四大药学核心课程中学习难道相对较大的。本课程基本涵盖了临床常用的大部门药物，教学内容多，药物的药理作用和作用机制理解有一定难度，药名名称也不容易记忆。教学资源、教学模式单一，使得抽象的知识变得更加枯燥难懂，降低课堂学习效率。
2 教学方法改革方案和目标
针对目前药理学教学存在的问题，提出课程的教学改革方案。
1）针对学时减少，前期基础薄弱特点，删减相关临床不常用的药物章节，删减难度较大的部门药物的药理作用和作用机制章节。
2）将难度大的章节的药理作用和作用机制通过图表、动画等形式讲解，力求生动形象清晰，同时讲部分机制简化。
3）增加多种教学方法，引入比较法、图表法、案例教学法。
改革目标：
（1）通过本课程的学习，要求学生熟悉常用药物的作用机制、药理作用、临床应用。理解该药物为什么能治疗某类疾病，如何合理使用。
（2）识记了大量药名，为相关专业课程药物化学、药物制剂提供一些专业基础。为后期药师、执业药师考试做好相应知识储备。
拟解决的关键问题：将药理学课程由抽象复杂转化为生动形象，丰富课堂教W内容，调动学生的能动性，提高课堂效率，使学生能切实提高实际应用能力[2]。
针对学科特点，结合多年的教学经验和学生学习的反馈情况，拟对药理学的的教学方案做一些改革和探索。
3 教学内容模块化的整合
按照药物的分类以及课程特点，删除临床不常使用的药物的章节，同时将临床常用的重要的药理学内容的几十个章节整合分成七大模块进行教学[3]。每个模板内部再分成几个有机联系的单元，使学生能够融会贯通的掌握各个模块内部的知识，同时注意区分各章节药物的差别，便于学生记忆和复习。具体如下
3.1 药理学总论模块
1）绪论；2）药物效应动力学；3）药物代谢动力学；4）影响药物作用的因素
3.2 作用于传出神经系统的药物模块
1）概论；2）胆碱受体激动药及胆碱酯酶抑制药；3）胆碱受体阻断药；4）肾上腺素受体激动药；5）肾上腺素受体阻断药
3.3 作用于中枢神经系统药物的模块模块
1）镇静催眠药；2）抗癫痫药和抗惊厥药；3）抗精神失常药；4）解热镇痛抗炎药；5）镇痛药
3.4 作用于心血管系统的药物模块
1）抗心绞痛药；2）抗高血压药；3）抗心律失常药；4）抗慢性心功能不全药；5）调血脂药
3.5 作用于内脏系统的药物模块
1）利尿药和脱水药；2）呼吸系统药；3）消化系统药物；4）作用于血液系统药物；5）抗组胺药
3.6 作用于内分泌系统的药物模块
1）胰岛素和口服降糖药；2）肾上腺素皮质激素药物；3）甲状腺激素及抗甲状腺药；4）性激素
3.7 化学治疗药物模块
1）β-内酰胺类；2）大环内酯类；3）氨基苷类；4）四环素类和氯霉素类；5）人工合成抗菌药：磺胺类药、喹诺酮类；6）抗真菌药；7）抗病毒药；8）抗结核药；9）抗寄生虫药；10）抗恶性肿瘤药
4 教学单元的优化设计
对于每个教学单元，采用项目化教学法，总体设计中已经讲教学内容按照疾病类型分为七大模块，模块内部再将章节细化，每一类药物的学习设定为一个教学单元，采用以下方案。
1）导入：用该章节药物在药物发现历史上的故事，如诺贝尔奖的故事或者相关历史人物趣闻或者相关生活趣味点等导入，增加学生学习兴趣[4]。
2）通过药理作用和作用机制的讲解，解释清楚为什么此类药物能治疗这种疾病，让学生有一种豁然开朗的感觉，觉得这个课程学的有意思。
3）介绍各类药物在临床上如何合理选用，贴近生活实际，使学生觉得该课程有一定的实际意义。
4）小结：总结重点难点，布置课后任务。
5 课堂教学方法改革
1）项目化教学法[5]：根据岗位需求特点，对常见病，如高血压，糖尿病等采用项目化教学法，让学生掌握常见病几大类药物的合理选用，使学生能独立面对岗位。如高血压有常见一线五大类药物，通过图表等多种方法，让学生掌握五类一线药物的临床用途及不良反应，面对高血压病人能详细介绍各类药物特点，使病人用药放心，安心。
2）案例教学法：鉴于传统填鸭式教学法学生死记硬背，老师课堂独角戏的局面，在介绍完每类药物之后，给出具体病例，让学生针对病例，合理选药，增加课堂趣味性和实际应用性。
3）比较教学法：对于部分内容相似度高，学生不易掌握的章节采用比较法。如心血管系统，高血压、心绞痛、心律失常等相似度高，不易区分的章节，适当增加学时，增加案例。哪些药物可以同时治疗三中疾病，哪些药物只能治疗其中一种疾病，进行区分。
4）重点难点分析：重点在于，药理学内容枯燥，采用多种教学方法，激发学生的学习兴趣；平时学习和记忆药名和用途，避免考前突击，考后即忘，以免工作后参加药师及执业药师的二次学习。难点在于，学时少，内容多，在最少时间内让学生掌握最需要的知识点；同时授课对象有药学类、管理学类等不同学科背景学生，需要因材施教，区别对待。
6 结语
通过教学内容模块化的整合，教学单元的优化设计，以及课堂教学方法的改革，使学生对药理学的学习避免了苦衷乏味，掌握W习规律和学习方法，对药理学的学习有一种全新的认识，提高了教学效果和教学质量。对于提高高校药学类课程的教学质量的具有一定的意义。
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【关键词】 血清药理学;研究方法;综述
中药血清药理学是近年来逐渐发展起来的研究中药药效较为科学的一种方法。它是由日本学者田代真一于1988年首次提出的,该方法就是将动物灌服给予中药或复方制剂后,在一定时间采集血液、分离血清进行体外药效实验。1990年,姜廷良教授[1]将它引入我国,之后国内许多学者和专家进行了大量的研究工作,取得了可喜的成绩,积累了一定的经验,为中药作用机制和物质基础的深入研究奠定了基础。我国已将它列入国家自然科学基金资助范围[2],现就其研究应用现状作一综述。
1 中药血清药理学方法在我国的应用现状
1.1 对中药解热作用的研究 杨奎等[34]研究含黄芩、藿香、羌活胜湿汤和九味羌活汤的血清对单核细胞内DNA合成、Ca2+内流的影响,发现:含黄芩血清能明显抑制单核细胞内DNA合成,抑制Ca2+内流,因而能阻止内生致热原的合成;而含藿香、羌活胜湿汤和九味羌活汤的血清对单核细胞的合成的抑制作用依次增强,含香薷血清呈明显量效递增性抑制作用,含羌活胜湿汤和九味羌活汤的血清两者在大剂量时却呈促进作用;对单核细胞内流的影响,香薷的作用较九味羌活汤弱,但均呈量效递增性抑制作用,而羌活胜湿汤则与此相反,在较大剂量时翻转为促进Ca2+内流作用;时效关系表明,九味羌活丸对内流的抑制作用在给药后90min达高峰,对DNA合成的抑制作用在给药后30min和90min间较明显,对蛋白质合成的影响在给药后120min内呈轻微促进作用。该实验表明采用中药血清药理学方法进行中药时效关系研究,有较大的优势。
1.2 对中药抗肿瘤作用的研究 杨振江[5]等研究表明:含髓清丸中剂量组和高剂量组血清活细胞百分率均较对照组低,OD值明显低于对照组,中剂量组和高剂量组细胞毒活性均大于20%,高剂量含药血清组G1期DNA含量明显低于对照组,中剂量组凋亡细胞百分率较高。髓清丸能抑制HEL细胞的增殖,并有一定的诱导HEL细胞分化、凋亡的作用。张建军等[6]研究发现:富硒绿茶药物血清对人肝癌细胞株能抑制生长,抑制克隆,减少AFP和γGT的合成和分泌,促进ALB的合成,且呈现一定的浓度、时间依赖关系,对人肝癌细胞株恶性表型有逆转作用,可诱导癌细胞向正常方向分化。王力倩[7]等应用中药血清药理学方法观察了含苦参、仙鹤草的血清及其煎剂对肿瘤细胞体外生长的影响,结果发现,除含仙鹤草血清外,其余都可明显抑制S180细胞的生长。初步证明苦参对肿瘤细胞体外生长确有细胞毒作用,而含仙鹤草血清与其煎剂出现了不同的实验结果,可能与中药粗颗粒制剂干扰因素或与动物体内代谢过程及血清影响有关。
1.3 对呼吸系统的作用的研究 小柴胡汤:研究发现,小柴胡汤浓缩液直接加入到细胞培养基中有致有丝分裂作用,而用小柴胡汤的血清则无此作用。小柴胡汤的致有丝分裂作用,可能是由一些不能从胃肠道吸收的大分子物质产生,或因有效成分经消化道或肝脏代谢失效所致。小青龙汤:黄坚[8]等法研究发现,服用小青龙汤煎剂的豚鼠血清,具有显着抗组织胺引起的离体豚鼠气管平滑肌收缩作用,且呈良好的量效关系,与用煎剂直接进行的离体药理实验的药理效应相似。
1.4 对心血管系统的作用研究 邱幸生等[9]通过实验表明:益气通络方低、中、高剂量含药血清处理组心肌细胞bcl2阳性表达比例均较单纯缺氧再给氧组(H-R组)有显着增高,提示bcl2具有保护心肌细胞的作用。隋因[10]等观察灌胃给予红花提取物的家兔的含药血清对豚鼠离体的心脏的作用,发现灌胃给予红花提取物5、10、20g-1后,含药血清均能显着增加豚鼠离体心脏冠脉流量,增强心搏幅度及减慢心率。并在灌胃给予红花提取物后60min所采血清的指纹谱中出现一些新的峰。陈长勋[11]等采用中药血清药理学方法观察了附子对离体豚鼠左心房收缩力的影响,结果发现,口服附子粗颗粒制剂后的动物血清与未服药的动物血清比较,具有明显增强心肌收缩力和加快心肌收缩速度的作用,且于给药后2h血清作用达到高峰,从而证明附子强心有效成分能经胃肠道吸收入血,且不会一经吸收而失活,说明附子口服有效。张群豪[12]等研究表明:血府逐瘀煎剂浓缩液和含药血清对实验性动脉粥样硬化家兔主动脉平滑肌细胞(SMC)增殖有抑制作用,并呈剂量依赖性,且煎剂浓缩液作用强于含药血清,而空白血清则无此作用,该实验为血府逐瘀的临床应用提供了科学依据。
1.5 对免疫功能的影响作用的研究 梁春敏[13]等研究发现:玉屏风散试验血清在灌胃后30min~2h时对小鼠脾淋巴细胞增殖、小鼠IL2产生均有明显促进作用,其中以1h时作用最强,1h时对小鼠免疫功能有显着增强作用。曾南[14]等观察了灌服雪莲虫草精大鼠的抗凝血对NK细胞活性的影响。结果表明给药物抗凝血可明显增强NK细胞活性,给药动物血清1.25g/kg剂量组能增强IL-2活性,但7.5g/kg剂量组作用不明显,而3.75g/kg剂量组则出现抑制作用,这可能与血清的稀释度与内容物有关。
1.6 对中药抗菌作用的研究 杨奎[15]等应用中药血清药理学方法进行了中药体外抗菌实验,发现含藿香正气水、藿香正气液及黄芩的血清分别具有明显的抑菌作用,抑菌率在70%以上。该研究发现:一些含中药血清却表现为促进细菌繁殖作用;同时中药复方、单味中药均可出现多个抑菌高峰,提示中药抗菌成分复杂,其吸收高峰时间不一致,有利于抑制细菌繁殖。这说明中药血清药理学可用于检测或反映中药不良反应。
1.7 对中药抗炎的作用的研究 研究中药赤芍、黄连、牡丹皮、生姜、黄精、黄芩对花生四烯酸生物转化的影响时发现,含黄连、赤芍的血清可抑制花生四烯酸的生物转化,而其煎剂则无此作用。与此相反,生姜、牡丹皮、黄芩、黄精煎剂有抑制作用,而其含药血清则无效。
1.8 对骨骼系统的作用的研究 韩立民[16]等以淫羊藿给大鼠灌胃和肌注连续7天,末次给药90min后股动脉无菌取血灭活、进行成骨细胞(OB)培养。研究表明:服淫羊藿后的大鼠血清碱性磷酸酶活性显着增高,细胞内蛋白质含量增高,成骨细胞的数量增多,培养基中钙含量明显降低,剂量与作用呈正相关性,表明该药是抗骨疏松症的理想药物之一。任光友[17]等用血清药理学方法,在新生大鼠头骨成骨细胞培养液中,分别加入不同浓度的老年大鼠含羊蓝合剂(YLM)血清,结果发现中、高剂量组含羊蓝合剂(YLM)血清对成骨细胞增殖率、成骨细胞ALP活性、成骨细胞BGP分泌,均有明显增长作用,说明老年大鼠含YLM血清对成骨细胞的增殖和分化功能具有增强作用。
1.9 对中枢神经系统作用的研究 李翠屏等[18]用Daniel方法建立神经元缺氧凋亡模型,加入益气通络方药物血清,应用碘化丙啶采染色法经流式细胞仪检测神经元凋亡率,分光光度法检测MDA、NO浓度,免疫组化法检测bcl2表达,研究表明:益气通络方能显着抑制缺氧导致的神经元凋亡,并减少神经元缺氧过程NO、OFR的生成,上调bcl-2基因的表达。聂伟[19]等运用血清药理学方法观察六味地黄汤(LW)及其活性组分(CA4、CA4-3)含药血清对原代培养胚胎大鼠海马神经元的保护作用。结果发现:LW及CA4、CA4-3含药血清均可不同程度地提高海马神经元的存活率,并且与稳定线粒体膜电位与其神经保护作用具有密切关系。其作用机制有待进一步深入研究。而老年痴呆患者与中枢能量缺乏、神经元数目减少与其线粒体功能障碍密切相关,提示该方法可用于老年痴呆的研究。
1.10 对消化系统的作用的研究 刘成海[20]等研究表明,含扶正化瘀方的血清能明显抑制肝贮脂细胞增殖,与药物剂量及血清浓度呈正相关性,而且对贮脂细胞内外胶原也有一定的抑制作用。曹宜[21]等通过观察CC14、DGaIN+LPS和BCG+LPS诱导小鼠肝损伤茵陈蒿汤醇提物的氯仿、乙酸乙酯萃取部位及剩余乙醇提取物降低ALT活性的作用,发现茵陈蒿汤醇提物的氯仿再提取部位的小鼠血清对DGaIN诱导大鼠的原代肝细胞ALT活性水平表现出稳定的降低作用。李平[22]等研究发现:软肝冲剂药物血清对传代的HSC增殖有明显抑制作用,能显着抑制HSC分泌TGFβ1,其作用与秋水仙碱相仿,可能是通过抑制细胞DNA合成及其有丝分裂,或抑制PDFβ1的产生及其受体表达,阻断其信号传导,减少TGFβ1的分泌,下调I型胶原的基因登录来实现抗肝纤维化的机制的。
1.11 对生殖系统的作用的研究 夏誉薇[23]等以50例不孕患者作受试对象(中药组40例和西药组10例),利用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)模型评价女贞孕育汤的血管生成活性和促进血管生成的作用,结果发现:在中药组和西药组治疗前后卵泡期、排卵前、经前期血清的比较,均有显着性差异。王明军[24]研究发现:用傅氏生化汤的水提浓缩液、水提醇沉物、挥发油、醇提浓缩液分别给小鼠灌胃,在一定时间内取其血清经过灭活后,以各给药组灭活后的灌胃给药血清供试液代替药物供试液,结果表明,水提醇沉物具有促子宫收缩的作用,而且强于离体实验的结果。
2 中药血清药理学研究方法的优势和存在的问题
2.1 中药血清药理学研究方法的优势 中药血清药理学是在以往体外实验的基础上加以改进而形成的,即以含药血清代替中药粗提物进行实验,因而它最大的优点是:条件可控性强、揭示药物作用机制较为深入、重复性好、使用材料少、更接近药物在体内环境中产生药效的真实过程等。其主要优势具体如下:(1)采用含药血清培养细胞可直接观察中药的药物学效应,便于应用细胞学和分子生物学手段,从基因、基因产物、药物受体和酶活性等诸方面阐述药理机制。(2)使现代科学技术与传统医学有了一个可行的切合点,有利于应用现代生命科学的技术手段和理论揭示中药复方配伍的实质,从而推动中医药的科技进步。(3)便于观察和追踪药物吸收和代谢的过程,消除体外实验各种干扰因素的影响,以便于较为清楚地认识复方药物中主要药物的有效成分及活性部位,为进一步开发药物提供依据。
2.2 血清药理学研究方法存在的问题 中药血清药理学本身是一门方法学,从它引进到我国到现在只有短短的十多年的时间,因而存在不少有待进一步改进之处:(1)血清学本身是一门方法学,其自身组分的复杂性至今尚未完全清楚,血清本身复杂的成分会影响体外实验的结果,而中药复方组分也是一个未知体系,两个未知体系的叠加使原本复杂的体系更加复杂;而就目前的技术手段,尚不能分析复方血清中所有的单一成分,即无法详尽地比较分析每一单一元素在复方中所起的作用,这无形中限制了中药血清药理学在中药复方中的应用范围。(2)药物血清的制备中,规范动物给药方案和采血时间,确立药物的时效关系和量效关系一直是中药药理研究的焦点。而且由于实验动物种属的不同或种属相同年龄性别的不同,都能引起实验动物对药物敏感程度的差异以及对复方药物中不同组分的吸收、转化、作用靶点的相异,因此实验动物的种属和年龄性别的选择有待规范。(3)在体外培养体系中,不可能添加100%浓度的血清,而且不是所有的中药都通过血液起作用,有的是对消化道直接作用,有的是通过局部起作用,这是血清药理学难以解决的。(4)辨证论治是中医诊断疾病的方法和特点,尽管实验医学已经有人将实验与证型相结合,但在实验学中却往往忽视中医内涵,如何将辨病论治与辨证论治结合是血清药理学需要解决的问题。
3 对中药血清药理学的展望
尽管中药血清药理学的应用、方法存在不少问题,但作为一门新兴方法学,它在复方药理学研究中具有不可代替的作用。随着中药血清药理学所存在的问题的逐步解决、方法更进一步的成熟和完善,它将更广泛地应用于:(1)复方药物的评价,具有直接的、快速的、敏感的、准确的作用等特点;(2)复方药物的机制研究,血清药理学是复方药物的机制研究主要研究方法之一,随着化学分析手段的的完善,复方药物中有效成分的逐步确认,其药理学机制也终将被揭开;(3)老年痴呆等慢性病及微生物学、分子生物学、药理学和生理学、免疫学等学科的研究。
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[关键词] 高职 药理学 教学方法 改革探讨
药理学是一门研究药物与机体之间相互作用规律的一门科学，也是药学与医学之间的桥梁和纽带。学生通过学习和掌握药理学的基本理论、基本知识和基本技能，指导临床合理用药，开发新药和老药新用途，并为制药工程的发展提供理论依据。学习药理学的主要目的是使学生理解药物的作用、作用机制、临床应用以及不良反应，掌握药物的有效性、安全性及应用合理性。
药理学内容繁多复杂，理论抽象枯燥，学生不易理解，同时传统的药理学教学只是单一的课堂讲授， 同时传统的药理学教学只是单一的课堂讲授，教师通过语言、文字等向学生传达信息、面授知识，这种教学方法单调、乏味、空洞，学生死记硬背、生搬硬套、负担沉重，处于被动状态。由于药理学是高速发展的学科之一，新的药物不断出现，新的理论和治疗方法不断出现，加之药名繁多，且不易记忆。因此如何使学生变被动吸取知识为主动学习知识，引导和培养学生的获取和归纳药理知识，灵活运用药理知识的能力，是药理学教学改革的重点，对培养高素质制药人才具有重要意义。
1 理论教学方法改革
合理地使用多种教学方法。一般采用多媒体教学课件结合板书，以系统性讲授为主，引导学生全面了解、把握药理学基本知识、基本理论、基本方法；在课堂授课过程中，贯穿启发式教学理念，不断提出能促进学生思考引起学生重视的问题，激发学生的学习兴趣，加深学生的所学内容的理解，并提高学生的科学素养。为了提高学生学习的积极性，如果条件可以，适当制作些简单的动画，使药物作用机制的抽象内容变得生动形象，易于学生接受。
同时，为培养学生积极主动地学习知识，归纳知识和灵活运用知识的能力，还可以开展“问题式学习”的教学模式。由一名教师指导10-20名学生，针对典型病例和药理学习中的疑难问题组织讨论。上课90分钟内，前20分钟，教师做好课题内容介绍，并准备好有针对性的思考问题，经过10分钟思考准备，学生按照小组为单位发言（大概40分钟），其间老师作必要的引导和补充，最后20分钟教师对每个发言进行总结、点评[1]。该教学模式既调动了学生的学习积极性，促进了基本理论和基本知识的学习，同时充分发挥学生的主体性，增强学生自学能力、分析和解决问题的能力，以及团队合作精神。
2 实践教学改革
药理学实验课中不乏经典实验，对这部分实验内容实验目的要明确，教师所提出的问题应该是启发式的，同时切忌包办所有“问题”的设定，应该鼓励学生在分析教师设定的问题情景的基础上提出问题，并在教师的帮助下完成问题的解答，当然，问题的提出都应该围绕实验目的来完成。在实验结果的分析方面，应指导学生查阅相关文献和资料，鼓励学生大胆提出自己的看法。当然，药理学实验教学最好采用先进的生理药理实验微机教学系统，实现实验参数的统一性, 实验结果的平行性, 同时规范了学生的实验操作，实验结果随时可以存盘、读取和打印, 提高实验教学质量和安全性，提高学生对实验的兴趣。
3 教学手段改革
在科技高度发展的今天，教学手段日新月异。现在，我们基本停用了板书、挂图等手段，而以多媒体课件为主要手段进行教学，看标本、看录像、看临床上常用代表药物药品说明书等方法帮助学生更加了解药理学专业知识，掌握扎实的药理学知识，提高学习成绩，收到非常好的教学效果，也受到同学们的好评。对重要的的概念和代表药以教师讲授为主，尽可能讲深、讲透；对其它同类药的特点让学生讨论并列表比较或自学，删去教材中临床已很少使用的药物，增加部分教材中没有而临床常用的新药。注意调动学生学习积极性，指定自学参考书并布置一些课后思考题，督促学生进行自主学习。定期开展形成性评价，如提问、小测验、批改作业和实验报告等。
多媒体辅助教学能够充分利用色彩、动画、声音、图形等形式，以直观、新颖、活动的图像和画面展示教学内容。这种信息的表达形式具有很强的吸引力，可以让学生通过多个感觉器官来获取信息，最大限度地接收信息。药理学需要背诵记忆、抽象理解的内容很多，在学习过程中会显得枯燥乏味而导致厌学情绪。多媒体教学的优点是可以将动态影像、图片色彩、文字声音等各种信息紧密地结合在一起，提供图文并茂、声像俱佳、动静结合、新颖逼真的教学内容。特别是利用多媒体造成的视觉、听觉刺激，充分调动了学生学习的主动性，大大激发了学生的学习兴趣。例如通过观看具体药物口服的吸收过程，使学生非常形象地掌握了何谓“首关消除”以及首关消除显著的药物可以采用舌下含服的给药途径等比较抽象的概念，这样不仅加深了学生对所学知识的理解与记忆，也有助于知识要点的记忆保持，同时也可节约教师在传统教学模式中板书绘图的时间。另外，通过多媒体教学还可以展现板书教学无法演示的宏观和微观世界，使学生能更好地掌握教学内容。例如在讲授“抗心律失常药物”时，教师一般先要复习生理学中心脏电生理的有关内容，并讲解心律失常发生的机制，因为这些往往都是学生学习的难点[2]。可以采用多媒体教学，利用动画，通过直观的心肌电生理图像的展示和动态对比，引导学生比较、总结，这样可以使学生高效而牢固的掌握知识，同时多方面提高学生能力。利用多媒体技术信息量大、多渠道的特点，可以扩大课时容量，丰富教学内容。
4 考试方式的改革
考试是检查学生学习成果和教师教学效果的重要方式，是学生学习成绩的阶段性、总结性的检查与评定。药理学理论考试应做好有目的的要求，对于高职制药专业学生，偏向使用开卷考试的形式，考试内容要偏向于新药知识或药物新的使用方法等，让学生掌握今后制药发展的趋势。实践考试要求学生掌握基本的药理实验技术。改革考试题型，部分题型参照执业医师、药师、公共卫生医师等资格考试题型。及时更新试题库，考前自动组卷，实行教考分离。
参 考 文 献
【关键词】 板蓝根 化学成分 药理作用 质量控制 提取工艺
Recent Progress in the Studies of Chemistry，Pharmacology，Quality Control and Extraction Methods on the Radix Isatidis
AbstractObjectiveTo make a review of Radix Isatidis in chemistry，pharmacology，quality control and extraction methods．MethodsThe documents were classified and summarized by chemical constituents，pharmacological effects ，quality control and extraction methods．Results and ConclusionThe Radix Isatidis possesses complex chemical constituents， has actions as antibacterial，antivirus and stimulating immunity，but the quality standards and extraction process are not quite suitable and should be improved．
Key wordsRadix Isatidis； Chemical constituents； Pharmacological effects； Quality control； Extraction process
板蓝根Radix Isatidis是我国的传统中药，始载于《神农本草经》。《中国药典》（2005年版）收载的是十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort．的干燥根，具有清热解毒、凉血利咽的功能；广泛用于温病发热、发斑、喉痹、丹毒、痈肿、风热感冒等；可防治流行性乙型肝炎、急慢性肝炎、流行性腮腺炎、骨髓炎。现将板蓝根化学成分、药理作用、质量控制及提取方法的研究进展做如下综述。
1 化学成分研究［1～7］
1.1 生物碱类物质所含生物碱类物质中，吲哚类化合物有依靛蓝酮、靛玉红、靛蓝、羟基靛玉红、吲哚-3-乙腈-6-O- D-葡萄糖苷、2，3-二氢羟基地-氧吲哚-3-乙腈、(E)-3-(3′，5′-二甲氧基-羟基)-2-吲哚酮；(E)-2-［(3′-吲哚)腈基亚甲基］-3-吲哚酮；喹唑酮类化合物有3-羟苯基喹唑酮、4(3H)-喹唑酮、2，4，(1H，3H)- 喹唑二酮、色胺酮、板蓝根二酮B；喹啉类化合物有依靛蓝双酮；含硫类化合物有告依春、表告依春、1-硫氰基-2-羟基-3-丁烯；芥子苷类化合物有黑芥子苷、葡萄糖芸薹素、新葡萄糖芸薹素、1-硫代-3-吲哚甲基芥子油苷。
1.2 氨基酸类精氨酸、谷氨酸、酪氨酸、脯氨酸、缬氨酸、氨基丁酸、亮氨酸、色氨酸、天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸。
1.3 有机酸类化合物吡啶3-羧酸、顺丁烯二酸、2-羟基-1，4-苯二甲酸、苯甲酸、水杨酸、丁香酸、邻氨基苯甲酸、3-(2-苯甲酸)-4(3)喹唑酮、棕榈酸、亚油烯酸、芥酸、琥珀酸。
1.4 甾醇类化合物β-谷甾醇、γ-谷甾醇。
1.5 其他类化合物腺苷、多糖、板蓝根木脂素苷A、胡萝卜苷、远志醇、β正丁基-D-塔格糖苷［8］、板蓝根异香豆素A［9］、丁香苷、吲哚-3-乙腈-6-O-β-D-葡萄糖苷、(+)-异落叶松树脂醇［10］(2R)-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基- 1，4-苯并噁嗪-3-酮、(2R)-2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-4-羟基-1，4-苯并噁嗪-3-酮、松脂酚-4-O-β-D-芹菜糖基- (12)-β-D-吡喃葡萄糖苷和尿苷［11］等。
2 药理作用研究
2.1 抗菌作用［12］板蓝根水浸液对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草杆菌、八联球菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、甲型链球菌、肺炎双球菌、流感杆菌、脑膜炎双球菌均有抑制作用。
2.2 抗病毒作用
2.2.1 对一般病毒的作用［13］对板蓝根注射液作抗病毒实验，表明其对甲型流感病毒、乙型脑炎病毒、腮腺炎病毒、流感病毒有抑制感染并用抑制增殖作用。
2.2.2 对出血热病毒、单疱病毒的作用［14］将肾病出血热病毒（HFRSV）和单疱病毒(HSV-2)分别吸附于Vero-6细胞和BGM细胞，并分别加入不同浓度的板蓝根针剂做抗病毒实验，结果表明有明显的杀病毒作用。
2.2.3 对肝炎病毒的作用［15］板蓝根及地上部分（大青叶）有抑制HBsAg活性的作用，在体内胆红素单位时间排出量明显增加。
2.2.4 对人巨细胞病毒（HCMV）的作用人巨细胞病毒（HCMV）是宫内感染造成胎儿畸形、死胎的重要原因，同时也是免疫缺陷患者感染致死及器官移植失败的根源。孙广莲等［16］以3-(4，6-二甲基噻唑-2-xl)-2，5-乙苯基-四唑溴（MTT）法检测，考察板蓝根煎剂（φ=50%）对HCMV的抗毒效应。结果表明煎剂在1:200稀释度时即有显著的抗毒效应。
2.3 对内毒素的作用［17～20］内毒素是由细菌产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。板蓝根具有抗大肠杆菌内毒素的作用。经家兔热原检查法、鲎实验法研究证实，板蓝根氯仿提取物有抗大肠杆菌O111B4内毒素的作用，比较发现，不同产地板蓝根抗内毒素作用差异较大，有的抗内毒素作用为0.4U·L-1，而较低的只有0.001 U·L-1。有研究认为，板蓝根中抗内毒素活性物质为有机酸类。
2.4 对免疫系统的作用已证明板蓝根多糖对特异性及非特异性、体液免疫、细胞免疫均起到一定促进作用［21］。腹腔注射板蓝根多糖50 mg·kg-1可显著促进小鼠免疫功能，如能明显增加正常小鼠脾重、白细胞总数和淋巴细胞数，对氢化可的松所（HC）致免疫功能抑制小鼠脾指数、白细胞总数和淋巴细胞数的降低有明显对抗作用；显著增强正常及环磷酰胺所致免疫抑制小鼠的迟发性过敏反应；增强正常小鼠外周血淋巴细胞ANAE阳性百分率，并明显对抗HC所致的免疫抑制作用；促进单核巨噬细胞系统功能，增加小鼠静注碳粒廓清速率。多形核白细胞（PMN）吞噬和杀灭细菌的过程是机体的一项重要免疫功能，化学发光是PMN呼吸爆发的标志，产生多种具有强烈杀菌作用的氧活性基团，板蓝根低极性流分对PMN化学发光有双向免疫活性，在低浓度时具有激活作用，在高浓度时具有抑制作用［22］。
2.5 抗癌作用在体外细胞培养时，板蓝根注射液（φ=50%）对小鼠Friend病毒感染后诱导产生的3CL-8细胞有强大的杀伤作用，其最低作用剂量可达1∶80；小鼠注射3CL-8细胞处皮下注射50%板蓝根0.2 ml，1次/d，连续7 d，对实体瘤有一定的治疗作用，但腹腔注射本品对3CL-8细胞无杀伤作用，板蓝根中的有效成分靛玉红是抗肿瘤的主要活性物质［23］。
3 质量控制研究
板蓝根中所含化学成分较多，其中抗病毒成分还不是十分明确，因此国内各专家学者对板蓝根药材及其制剂的质量标准的争议很大。目前主要有将下列成分作为质量的控制的方法。
3.1 以靛蓝、靛玉红为指标性成分的质量研究以靛蓝、靛玉红为指标性成分的质量研究的报道较多，测定方法主要有高效液相色谱法、薄层扫描法和紫外分光光度法等。罗巍伟等［24］将板蓝根用70%乙醇提取，挥去乙醇后用氯仿萃取，采用HPLC法测定板蓝根的提取物中靛蓝和靛玉红的含量，色谱条件：Dikma DiamonsilTM C18色谱柱，流动相为甲醇-醋酸铵-醋酸(70∶30∶1)，流速1ml·min-1，检测波长280 nm，柱温40℃。外标法定量，靛蓝进样量在0.015 2～0.304 μg，靛玉红进样量在0.016 6～0.331 2范围内具有良好的线性关系。测得样品中靛蓝平均含量为8.820 μg·g-1，RSD=1.05%，平均回收率为97.3%；靛玉红平均含量为1.862 μg·g-1，RSD=1.26%，平均回收率为96.6%。邓慧敏等［25］采用双波长扫描法测定靛玉红的含量，将样品用定量毛细管吸取10 μl，对照品溶液1，3 μl分别点于同一硅胶G薄层板上，用苯-氯仿-丙酮（5∶4∶1）为展开剂展开，采用双波长反射法线性扫描，λs=540 nm，λR=700 nm，测定样品及对照品峰面积值，用外标两点法计算靛玉红的平均含量为1.45%。另有程力惠等［26］研究在薄层色谱板上采用“展开-挖点”法取样，用紫外分光光度法测定板蓝根中靛玉红含量，测得靛玉红含量为7.756 4 μg·g-1，回收率达96.58%。由于板蓝根制剂多为水煎煮提取，靛蓝、靛玉红成分在水中溶解度较小，且有文献报道板蓝根中的靛蓝、靛玉红主要存在于残留的叶柄、叶片和根茎中，根中含量很低［27］，因此将靛蓝、靛玉红作为板蓝根的指标成分进行控制仍需进一步探讨。
3.2 以多糖为指标性成分的质量研究板蓝根多糖具有免疫调节作用，对特异性免疫和非特异性免疫、体液免疫均有一定的促进作用，因此，板蓝根多糖也是评价板蓝根质量的一个指标。鲁建江等［28］用水提醇沉法提取板蓝根多糖，用酚-硫酸比色法测定多糖含量，测得板蓝根中多糖含量0.809 9%，平均回收率为98.74%，RSD=1.86%(n=5)，结果显示板蓝根中多糖含量不是很高。而盛家荣等［29］运用硫酸-蒽酮比色法测定板蓝根多糖含量，测得南板蓝根中多糖含量3.26%，北板蓝根中多糖含量达12.76%，从而说明北板蓝根的多糖含量较南板蓝根高。尽管对板蓝根总多糖有一定的研究，但到目前为止，尚未分离得到板蓝根的单体成分，也没有板蓝根多糖组成的报道，因此，以板蓝根多糖作为质控指标尚缺乏基础。
3.3 以氨基酸为指标性成分的质量研究氨基酸为板蓝根中含量较高的一类成分，达8.7%以上［30］，《中国药典》中将氨基酸类成分进行薄层色谱和化学反应鉴别作为板蓝根质量控制标准之一，但无含量测定项。何轶等［31］采用异硫氰酸苯酯柱前衍生法，用高效液相色谱法测定了板蓝根中精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸等5种游离氨基酸含量。结果显示，在13批样品中，精氨酸、脯氨酸含量较高，其中来源于河北安国的样品含精氨酸最高达6.35%，来源于北京的样品含脯氨酸最高达4.57%，此法不需要专门的氨基酸分析仪，操作简便，灵敏度高，结果准确可靠。
3.4 以有机酸为指标性成分的质量研究现代研究表明，中药材的清热解毒功效主要集中于其有效成分的抗内毒素作用和抗病原微生物作用，药理实验已证实，板蓝根中有机酸类成分具有明显的抗菌、抗内毒素作用。金薇等［32］以电位滴定法测定复方板蓝根冲剂中总有机酸含量，5批样品平均总有机酸含量为218.08 mg/袋，马莉等［33］对板蓝根中有机酸类成分进行分析，采用酸碱滴定法测定总有机酸含量为13.0%，RSD 2.0%，反相高效液相色谱法测定板蓝根提取物中水杨酸含量为0.22%，RSD1.6%，并建议将有机酸作为板蓝根提取物质量控制的依据。
3.5 指纹图谱控制质量的研究近年来，中药指纹图谱发展迅速，指纹图谱是反映中药多种成分特点的一种质量控制技术，也是中药现代化的一个重点内容。板蓝根及其制剂的质量很难找到一个指标性成分进行有效地控制，多成分综合评价的质量控制体系较为客观。曾令杰等［34］研究了板蓝根颗粒氨基酸部位的指纹图谱，由于氨基酸没有紫外吸收，以DNFB柱前衍生化的HPLC法，BDSC18色谱柱（4.6 mm×250 mm）为分析柱、pH 6.4的醋酸钠缓冲液-乙腈（95∶5）梯度洗脱，紫外365 nm下建立氨基酸部位的指纹图谱，以角余弦系数和距离系数来计算不同批次的样品之间的质量一致程度，结果显示精密度、稳定性和重现性良好，此方法可有效地判断和控制板蓝根的质量及其工艺过程的稳定性。
4 提取工艺研究
以板蓝根为原料的中成药制剂较多，如板蓝根颗粒剂、板蓝根注射液、板蓝根片、清开灵注射液、抗病毒口服液等，所有这些制剂均是以水提取的水溶性成分作为有效部位而制成。《中国药典》规定的板蓝根颗粒的生产工艺也是采用水煎醇沉法。张建军等［35］用双波长薄层扫描法测定了板蓝根水煮物、水煮物残渣、95%乙醇提取物、50%乙醇提取物中靛蓝和靛玉红的含量，结果为醇提法中靛蓝、靛玉红的含量很高，水煮法提出的靛蓝、靛玉红的含量甚少，几乎全留存于残渣中。陈玉生等［36］通过用50%～90%乙醇（梯度10%）对提取靛玉红的比较，发现70%乙醇对靛玉红的提取效率最高，建议新工艺以70%乙醇作溶剂提取。
5 结语
近年来对板蓝根的研究比较多，特别是板蓝根对SARS的防治作用肯定后，再次成为人们研究的焦点和热点，随着中药现代化的推进，许多疗效确切的名优中药的二次开发研究进展迅速，目前板蓝根抗菌、抗病毒等活性成分不是十分清晰，其质量控制究竟以何种成分为测定标准，也存在一定的分歧，为了更有效地利用这一资源，有必要进行深入的研究与开发。
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【摘要】 总结 中药代谢组学研究中生物样品(尿液、血液)的前处理方法，主要包括：尿液中加入缓冲液提供相同的ph值和离子强度，保持代谢物化学位移的恒定。利用有机溶剂沉淀法除去血液中的大分子物质，增加色谱柱的性能和使用寿命。血液和尿液样品在进行gc?ms分析前要进行衍生化处理。同时，对尿液和血液的采集与储存方法进行了总结。
【关键词】 中药;代谢组学;样品前处理
abstract: in order to reduce the chemical shift variation,the ph and the consistency of ionic strength were controlled by adding buffer to urine samples. in analysis of blood,efficient removal of macromolecules such as proteins by organic solvent precipitation before injection into an analytical lc column was important in enhancing the performance and extending column lifetime. sample derivatization of blood sample and urine sample before gc?ms analysis was needed. and methods of collection and storage of urine and blood samples were also reviewed.
key words:traditional chinese medicine; metabonomics; pretreatment
代谢组学(metabonomics)是继基因组学、转录组学和蛋白质组学后新兴的一种组学方法，是系统生物学的重要组成部分。中药“多组分、多靶点、整合调节作用”的特点与代谢组学整体性、系统性、综合性相吻合。因此，以代谢组学为主体的系统生物学研究方法可能是 现代 科学 中可以概括中医药抽象整体观思想的重要途径。王广基等对代谢组学技术在中医药关键科学问题研究中的应用前景进行了分析[1]。作者综述了代谢组学技术在中药整体疗效、作用机制及安全性等研究中的应用[2]。
代谢组学研究中的分析手段主要包括核磁共振谱(nmr)、气相色谱?质谱(gc?ms)和液相色谱?质谱(lc?ms)等各种高通量、高分辨、高灵敏度的谱学技术[3]。 nmr由于其具有很高的重现性、一次实验中实现对各种化合物的同时测定、信号强度与其摩尔浓度成正比，可以很容易进行定量分析、借助各种2d?nmr技术可以在对复杂样品不进行进一步分离的前提下实现结构鉴定等诸多优点而被广泛应用[4]。高分辨魔角旋转核磁共振技术(high?resolution magic?angle?spinning nmr spectroscopy)可以使研究者不经过提取等繁琐的步骤直接对完整的组织进行测定[5]。lc?ms特别是uplc?q?tof/ms以其灵敏度高、分析速度快、样品无需衍生化等优点，受到众多研究者的关注[6]。gc?ms作为一种经典成熟的分析技术在很多领域中应用广泛，其最大的优势是可以检索多个大型化合物库进行代谢物的结构鉴定，而且这也是代谢组学研究中关键的一个环节。气相色谱?飞行时间质谱(gc?tof?ms)由于提供了比四级杆质谱更快的分析速度、更高的分辨率和更准确的分子量应用日益广泛[7]。
可用于代谢组学研究的生物样品包括尿液、血液、脑脊液、组织和培养液等，最容易获取和应用最广泛的是尿液和血液。人类尿液的ph值一般在5.5～6.5，但在个别情况下可达4.6～8.0。尿液的成分主要是极性低分子量代谢物，其中包括羧酸类如柠檬酸、马尿酸;有机胺类如二甲胺(dma)、三甲胺(tma);氨基酸类如甘氨酸、牛磺酸。nmr测定时，不同ph值尿液中这些代谢物由于氨基或羧基的解离程度不同，化学位移将发生显著的变化。尿液中还含有一定数量的离子如na+ (90～240 mmol/l)、 k+ (34～68 mmol/l)等，可能产生不同的离子强度和络合作用，同样对代谢物的化学位移产生影响[8]。血液成分比尿液复杂的多，既包括低分子量成分也包括高分子量物质如蛋白和脂蛋白，lc?ms分析中，蛋白质的存在会严重降低色谱柱的性能和使用寿命[9]。因此，十分有必要在分析前利用适当的方法对样品进行前处理以消除不利因素的影响。本文总结了基于nmr、lc?ms和gc?ms技术代谢组学研究中对尿液和血液样品的前处理方法，希望能为此领域的研究者提供一定的 参考 。
1 尿液和血液的采集与储存
1.1 尿液的采集与储存
一般采集于置于冰上同时加入叠氮化钠(nan3，质量浓度至少为0.05%)作防腐剂的容器中，冷冻储存于-40 ℃的环境中[10]。另有研究报道尿液保存在低于-25℃的环境中，26周之内基本不会发生任何改变，而且不需要加入防腐剂，尽管nan3不会对代谢物产生任何影响。如果要短期(少于1周)储存于4 ℃的环境中，必须加入nan3作防腐剂，理想质量浓度为0.1%(终浓度)[11-12]。
1.2 血液的采集与储存
收集血液于含有肝素的试管中来制备血浆;收集血液于不含肝素的试管中，冰上凝集来制备血清，离心(1 600 g，15 min，4 ℃)，上清液冷冻储存于-40 ℃的环境中[10]。teahan等报道血浆和血清必须尽快与血细胞分离，距离血液采集时间最好不要超过30 min，以降低血细胞代谢发生的可能性，但是收集血清时凝集时间必须足够长，建议最好不要超过35 min，于冰上凝集可以降低时间延长带来的影响。血浆和血清所含有的代谢物成分基本相同[13]。
2 尿液的前处理
2.1 nmr分析中尿液的前处理
如前所述，尿液ph值和离子强度的变化引起化学位移的变化是nmr测定中的首要问题。加入缓冲液一方面提供尽可能相同的ph环境，另一方面减少离子强度不同带来的化学位移的变化， 文献 [10]报道了尿液详细的预处理方法。首先配制ph7.4磷酸缓冲液：称取28.85 g na2hpo4、5.25 g nah2po4、1 mmol/l tsp?d4 和3 mmol/l nan3置于1 l容量瓶中，加入200 ml d2o，然后用水稀释至1 l，强烈震摇使盐全部溶解。400 μl尿液中加入200 μl磷酸缓冲液，离心(12 000 g，5 min，4 ℃)，上清液550 μl转移至5 mm核磁管中。雄黄的安全性评价中采用了类似的方法：400 μl尿液中加入200 μl磷酸缓冲液(0.2 mol/l na2hpo4/0.2 mol/l nah2po4，ph7.4)，静置20 min，离心(3 500 g，5 min，4 ℃)。上清液500 μl加入50 μl tsp?d4/d2o(1 mmol/l终浓度)[14]。lauridsen等[11]报道对于一般的尿液样品缓冲液终浓度要达到0.3 mol/l，对于浓缩的样品要达到1 mol/l，才能较好地保持代谢物化学位移的一致性。上述磷酸缓冲液中，由于na2hpo4·12h2o较低的水溶性(4.2 g/100 g,20 ℃)，因此不可能实现高浓度的缓冲，缓冲液与尿样的比例为1∶2，这必然对样品进行了一定的稀释，从而降低了测定中的信噪比(snr)，而且低温储存时，na2hpo4·12h2o容易析出。xiao等报道了一种改进的缓冲体系：k2hpo4/nah2po4(ph 7.4，1.5 mol/l)，缓冲液与尿样的比例为1∶10，可更好保持化学位移一致性，提高信噪比，减少样品稀释，并且可低温储存[8]。
2.2 lc?ms分析中尿液的前处理
尿液中的成分主要是极性低分子量代谢物，同时含有少量的各种细胞、微量的大分子物质及磷酸盐、硫酸盐等各种盐类物质，这些都有可能对lc?ms分析产生一定的影响。最简单的尿液处理方式是仅用0.22 μm分析滤膜过滤，这可以最大限度保留尿液中的代谢物[15]。为降低尿液基质的干扰，也可以用蒸馏水进行稀释(1∶1～1∶4,体积比)[16-17]，但有可能降低信号强度，部分低含量的代谢物可能检测不到[15]。综合考虑检测到的代谢物的数量、重现性及除去微量蛋白质和各种盐类物质的能力，wong等建议尿液用甲醇(1∶1，体积比)进行稀释[18]。尿液可以先冷冻干燥然后用有机溶剂如甲醇进行提取，这种方法可以获得重现性比较高的结果，而且操作简单[19]。但是这种方法可能会改变尿液的代谢指纹，一方面是由于很难完全溶解冻干产品，另一方面是由于挥发性成分的丢失[11]。
2.3 gc?ms分析中尿液的前处理
尿液中的大部分成分极性比较大而且没有挥发性，因此在进行gc?ms分析前首先要对尿液进行衍生化处理。三甲基硅烷试剂只能用于非水系统，贾伟课题组采用氯甲酸乙酯(ecf))衍生化 gc?ms方法测定大鼠尿液中的内源性代谢物，该方法经多次检验，重复性好、灵敏度高，适用于代谢组学研究的高通量尿液样本检测[20-22]。
3 血液的前处理
3.1 nmr分析中血液的前处理
文献[10,23,24]报道了血液详细的预处理方法。首先配制质量浓度0.9%的生理盐水：称取9 g nacl置于1 l容量瓶中，加入100 ml d2o，然后用水稀释至1 l，强烈振摇使盐全部溶解。200 μl血液中加入400 μl生理盐水， 离心(12 000 g， 5 min， 4 ℃)，上清液550 μl转移至5 mm核磁管中。雄黄的安全性评价中采用了与尿液类似的处理方法：400 μl血液中加入50 μl磷酸缓冲液(0.2 mol/l na2hpo4/0.2 mol/l nah2po4，ph7.4)和50 μl d2o [14]。
3.2 lc?ms分析中血液的前处理
首要的问题是除去血液中的蛋白质等大分子物质，一般常用有机溶剂沉淀法如甲醇或乙腈(3∶1，体积比)，bruce等利用一种全新的两步实验设计法，首先确定了最佳的沉淀剂为甲醇/乙醇(1∶1，体积比)、甲醇/乙腈/丙酮(1∶1∶1，体积比)，与血液样品的体积比为4∶1，然后确定了最佳的旋涡温度和时间分别为4 ℃、15 min[9]。michopoulos等 发展 了一种适合于高通量分析的固相萃取(spe)除蛋白质的方法，在代谢组学研究中其效果优于有机溶剂沉淀法[25]。
3.3 gc?ms分析中血液的前处理
如同尿液一样在进行gc?ms分析前首先要对血液进行衍生化处理。黄欣等采用n?甲基?(三甲基硅烷基)?三氟乙酰胺(mstfa)和三甲基?氯硅烷(tmcs)(100∶1，体积比)作为衍生化试剂[26]。
4 讨论
代谢组学的最终目标是对特定生物样品中所有代谢组分进行定性和定量分析，目前看来还是不可完成的任务。尿液和血液因为其固有的性质，必然会对nmr和lc?ms的分析产生各种不利的影响，因此，在分析前利用适当的方法对样品进行预处理以消除不利因素的影响就显得十分有必要，这也为后续的多变量数据分析、标记物识别和代谢途径分析等奠定了良好的基础。系统生物学尤其是代谢组学的出现，为利用 现代 生物学“语言”阐释传统中医药理论提供了可能，以系统“整体性”观念为出发点，采用近乎无创伤的实验手段和代表整体功能状态的实验对象(采集尿液和血液)，结合现代分析技术和多变量统计分析方法，必将搭建传统中医药和现代医学之间的“桥梁”，推动中药现代化进程，并让国际社会逐渐接受和认同中医药理论体系，最终建立兼容中西医之长的现代生物医学模式。
[关键词] 认知弹性理论；学习方法；天然药物化学；知识框架
[中图分类号] R914 [文献标识码] C [文章编号] 1674-4721（2013）08（a）-0142-02
《天然药物化学》是五年制高职药物制剂技术专业的一门专业课，是应用现代科学理论与技术研究天然药物化学成分的一门学科。它研究天然药物中具有生物活性的各类化学成分的结构特点、理化性质、提取分离方法和主要类型化学成分的结构鉴定等内容。通过基本知识和相关技能的学习与实践，要求学生领会天然药物具有防病治病功能与其所含化学成分之间的密切联系。本学科课程的学习可分为总论和各论两部分，总论部分主要学习学科研究对象和研究内容、课程学习的任务和意义、生物活性成分提取分离的基本方法和过程、结构鉴定的常用手段与技术；各论部分为常见化合物类型，从结构特点、理化性质、提取分离和结构鉴定四方面学习。
1 《天然药物化学》教学方法改革的必要性
《天然药物化学》对于五年制高职的学生来讲，学习上存在一定的困难。一方面，学生的基础不扎实，如提取分离中萃取、过滤等基本操作，结构解析中氮杂环等基本知识，结构鉴定中高效液相色谱法等基本方法，在前期的分析化学、有机化学等课程中均已学过，但由于时间间隔较长，学生遗忘率较高，以致不能灵活应用知识与技能；另一方面，学生的学习方法欠缺，对于理论知识的学习，往往死记硬背，只会解不会析，对于实验操作只知道做不知道为什么做。鉴于此，经过几轮的《天然药物化学》教学实践，运用认知弹性理论的方法指导学生学习，锻炼学生知识迁移能力，提高学习效率。
2 认知弹性理论在教学领域中的研究
认知弹性理论是美国依利诺斯大学的斯皮罗等于20世纪90年代初提出的关于学习的本质问题的理论。斯皮罗等认为，人类的学习是非常复杂的，主张应该将学习分为两种：高级学习与初级学习。初级学习是学习的中低级阶段，在这一阶段，学习主要是还原倾向的简单化学习，只要求学生将所学的东西简单再生出来，涉及的内容主要是结构良好的知识，即此类知识与具体情境之间具有直接对应关系的知识。这种知识一经习得，就可根据相应的规则或原则加以运用。高级学习则要求学生把握概念的复杂性，能运用所获取的概念去分析、思考问题以及在新的情境中灵活运用这些概念。因此，这一阶段的学习涉及大量结构不良的知识，即此类知识与具体情境之间不存在直接对应关系的知识。这种知识通常可以应用于多种不同的情境问题，而一个情境问题的解决往往需要多个知识点的综合运用，而且其应用往往有多种方案、途径与标准。认知弹性理论是一种针对结构不良知识领域，以获得高级知识为目的的教学思想和方法。该理论强调建构知识的重要性，要求教师必须为学生提供机会开发他们自己的信息表征，使他们以更适宜的方式学习。
3 基于认知弹性理论的《天然药物化学》教学方法的改革
《天然药物化学》的教学内容不仅包括以抽象的概念和原理为主的理论知识，还包括通过学生动手操作理解和掌握的各项实践活动中的应用性知识，是理论知识和实践知识的统一。例如，教学中通常会遇到流程分析和流程设计的问题。流程分析是基于提取分离基本方法的一个应用分析，根据所给流程，结合化合物的性质，对其流程进行分析，而流程设计则需要根据不同化学成分的不同性质选用合适的提取分离方法。对于设计的流程有的则需在实践中验证其合理性和有效性。因此，教学重在发展学生的认知弹性，指导学生以多种方式重建自己的知识，以便对发生根本变化的情境领域作出适宜的反应。所以，对于学生学习方法的指导至关重要。
3.1 举一反三，知识迁移
《天然药物化学》中有些内容的学习可以通过总结归纳，并举一反三，有利于记忆和比较。①在学习每类化学成分提取的时候，通常都有一种方法为溶剂法，而溶剂法提取的要点在于选择合适的溶剂。如一般苷类物质，黄酮苷、蒽醌苷、香豆素苷等亲水性强，采用水或极性大的亲水性有机溶剂提取；游离态的黄酮、蒽醌、香豆素等亲脂性强，采用极性小的亲脂性有机溶剂提取。如此在学习皂苷、强心苷、生物碱、挥发油等成分的提取时，只要知道这些物质在自然界的存在形式、不同存在形式的溶解性能，就可以选择合适的溶剂进行提取。这样在教学过程中举一反三，可以达到事半功倍的效果。②学生记忆化学成分的形态比较困难。形态包括形、色、味等方面，有关“形”的问题，一般苷类多为无定形粉末，而糖基较少的苷或苷元多为结晶。有关“色”和“味”的问题，大多数成分为无色无味，而每次学到有色有味的成分时，就需要及时进行归纳整理。比如，黄酮、蒽醌、个别生物碱有色，生物碱、萜类、皂苷、强心苷等均味苦。学习相关成分时，举一反三，既巩固旧知，又指导学生如何及时归纳整理，找到适合自己的学习方法来理解和记忆知识。
3.2 寻找关键词，理清步骤要点
认知弹性理论中的高级学习要求学生把握概念的复杂性，能运用所获取的知识去解决新情境中的问题。因此，这一阶段的学习需要学生对前后知识有一个全面、系统的认识。但是天然药物化学知识理论性较强，有些知识需要记和背，但是死记硬背是行不通的，一方面要理解，另一方面，即使记和背，也有记和背的诀窍。其中寻找“关键词”的方法有助于学生理清知识要点。比如：①“什么是两性生物碱”这个问题，关键词在于“两性”二字。何谓“两性”，指的是酸碱两性，生物碱本身大多具有碱性，那酸性从何而来，联系有机化学中相关酸性基团问题，可知原来具有酚羟基、羧基等酸性基团的生物碱可称之为两性生物碱。②在生物碱显色反应排除干扰的问题中，书中写道：“可将生物碱酸性水提液碱化，使生物碱呈游离态，用氯仿萃取，游离生物碱转溶于氯仿中，蛋白质等水溶性杂质仍留存在水中，再将含有生物碱的氯仿液以酸水萃取，使生物碱溶于酸水中，取此酸液加入沉淀试剂”。让学生阅读完这段文字后，怎样理解这种方法呢？这种方法分几个步骤呢？找关键词“碱化”、“氯仿萃取”、“酸水萃取”、“沉淀”起到至关重要的作用。4个关键词找到后，4个步骤也就一清二楚，干扰成分在第2步被留存在水中，于第3步分离排除。
3.3 构建知识框架，梳理逻辑关系
《天然药物化学》研究的典型化学成分包括结构特点、理化性质、提取分离方法和结构鉴定等四方面。其中，理化性质与化学结构有密切的关系，而提取分离、结构鉴定与检识又以理化性质为基础，这是每类化学成分学习的一条主线，可谓是“纵线”关联；不同类别化学成分之间又有相似的结构特点、理化性质和提取分离方法，这又是不同类成分之间的“横线”关联。
例如，黄酮和蒽醌结构上都有羟基取代（结构特点），都会显酸性（理化性质），都可以用碱溶酸沉法提取（提取方法）。又由于羟基取代在不同位置（结构特点），其酸性大小不一（理化性质），因此，均可用pH梯度萃取法进行分离（分离方法）。这样的“纵线”联系和“横线”联系，教师在讲解过程中进行比较分析，学生在学习过程中整理归纳，构建知识框架，进行梳理和归纳，有利于学生的学习，提高学习效率。这不仅要求学生将所学的知识简单复述和再现出来，还要求能运用这些简单化的知识去分析、思考同类问题，并在新的问题情境中灵活运用这些知识和概念。
斯皮罗等人明确指出，传统教学在提高学生解决实际问题的能力方面表现出力不从心，原因在于将低级学习阶段的教学策略盲目地推及到高级学习阶段，使得教学过于简单化，这就好比目前职业教育中出现的将考试内容让学生通过简单记忆应付过关的现象，而非在理解的基础上，学会知识、学会应用、学会解题。《天然药物化学》的教学以认知弹性理论为出发点，以学生的理解性学习为主，在理解的基础上激发学生思考和应用知识与技能，为授课教师的专业成长和学生的综合素质提高都找到了最佳切入点。基于对《天然药物化学》教学与认知弹性理论的分析，发现认知弹性理论在职业教育专业课教学中有较强的适用性，运用恰当则可促进职业教育教学的改进与发展。
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关键词：血清药理学；肿瘤；细胞凋亡； 三磷酸腺苷酶；葡萄糖-6-磷酸酶
中图分类号：R285.5文献标识码：A
文章编号：1673-7717(2008)05-1108-02
Research Application of Blood Serum Pharmacology Method on Induction of Tumor Cell Apoptosisand Lowering of Enzyme Activity
CAI Shuo1，LIU Shan2，ZHANG Lihong1, Jin Chunfeng1, Liu Chunying1
（Liaoning University of TCM,Shenyang 110032,Liaoning China；2.Fourth People's Hospital of Shenyang,Shenyang 110032,Liaoning,China）
Abstract：Objective:To explore the application of blood serum pharmacology method in the research of inducing cell apoptosis and reducing the enzyme activity. Methods:Using Chinese native medicine serology method of treating the liver cancer, stomach cancer, lung cancer, big cancer of theintestines to discuss the effect of inducing tumor cell apoptosis, reducing the enzyme activity of ATP (Mg2+ - ATPase) and the glucose -6-phosphatase (G-6-Pase) of tumor cell. Results:①Four kind of different compound Chinese medicical blood serum all can induce the cell apoptosis of corresponding liver cancer cell lines ,A549 human lung cancer cell lines, CCL229 human colorectal carcinoma cell lines and cell line SGC7901. ②The activity of ATP and Glucose -6- phosphatase in tumor cell is decreased .Conclusion:The research application of blood serum pharmacology method on the induction of tumor cell apoptosis and the lowering of enzyme activity has the stability and the credibility.
Keywords:blood serum pharmacology;tumor;cell apoptosis;Mg2+-ATPase;glucose-6-phosphatase
20世纪80年代中期，日本学者Iwama H等率先提出“血清药理学方法”。此法是先给动物灌胃给中药，一定时间后再采集、分离其血清，并用此含药血清进行体外实验[1]。血清药理学方法已被广泛用于中医药作用机制的研究，研究层面已涉及到细胞增殖、分化、凋亡与细胞周期的调节以及基因表达等方面。本研究采用治疗胃癌、肝癌、肺癌、大肠癌等中药血清学方法，深入探讨其诱导肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤细胞三磷酸腺苷酶（Mg2+―ATPase)与葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)酶活性作用。
1 实验方法
1.1细胞培养主要试剂 抗肝癌、胃癌、肺癌、大肠癌等不同中药复方中的中药，均由辽宁中医药大学第一附属医院提供。
1.2中药制剂制备 将3个不同中药复方组成后传统煎制：中药清水浸泡2h，煮沸后文火煎15min，纱布过滤取汁，药渣加水再煎20min，两次药汁混合，浓缩为100%。
1.3药物血清制备 动物：SD大鼠由辽宁中医药大学实验动物中心提供。30只SD大鼠随即分为3组，即中药组10只，化疗组10只，对照组10只。实验前禁食12h，采用2次给药方法（第1次给药2h后重复等量给药1次），每100g大鼠灌胃中药制剂1mL，2次/日连续灌胃3天。化疗组、对照组生理盐水等量灌胃3天。分别在末次给药后1、2、3h采血，戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下，下腔静脉取血，静置4h，4℃，3000r/min 20min离心，分离血清，同种条件药物血清混匀，过滤，56℃30min灭活，-20℃保存，备用。
血清分组：中药血清组（中药组）、化疗血清组（西药顺铂-DDP组）、对照血清组（对照组）。（1）中药血清组：临用前将中药组大鼠血清加入PRMI1640培养液，浓度分别为5%、10%、20%。（2）化疗血清组：用含10%化疗组大鼠血清PRMI1640培养液，DDP的终浓度为5%、10%、20%。（3）对照血清组：大鼠血清中加入PRMI1640培养液，终浓度为5%、10%、20%。
1.4细胞株 肝癌细胞株、SGC7901胃癌细胞株、细胞株 A549人肺癌细胞株和CCL229人大肠癌细胞株和均由中国医科大学生物教研室卫生部重点实验室提供。
2细胞培养
将细胞从冻存于液氮中的安瓶取出，放入37～40℃水浴中1min内融化，无菌条件下打开安瓶，接种于2只无菌培养瓶中。加入10%小牛血清PRMI1640培养液，在5%CO2，37℃条件下CO2培养箱中培养，倒置显微镜下动态观察细胞形态，24h后见细胞贴壁生长状态良好，弃培养液，分别加入各组血清，继续培养。
3标本制备
3.1细胞凋亡 生长在培养瓶内的贴壁细胞用2.5%戊二醛4℃原位固定2h，用橡皮铲刮下细胞，转至离心管内，低温高速离心机2000r/min，15min，琼脂处理成块，PBS冲洗，1%锷酸（OsO4）后固定1.5h，梯度乙醇、丙酮脱水，Epon812树脂包埋，超薄切片机（LKB-V）切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜（JEM-1200）观察、摄片。
3.2酶细胞化学 取出培养皿中的载片，PBS冲洗，2%多聚甲醛固定30min，8%蔗糖脱水，3次×30min，分别加入Mg2+-ATP酶和G-6-P酶孵育液，37℃孵育45min，双蒸水冲洗，2min×3次，2%硫化铵成色，2min，双蒸水冲洗，2min×3次，梯度乙醇脱水各10min，甘油明胶封片，普通光镜下观察、拍片。
4 结果
4.1 细胞凋亡 ①正常对照组：各组肿瘤细胞株多为长梭形，表面可见较多的微绒毛，线粒体、粗面内质网、高尔基复合体、溶酶体等细胞器丰富、排列规则。②中药组：细胞表为椭圆形、圆形。表面微绒毛明显减少、消失。胞浆浓缩，可见大小不等的空泡，泡内容物电子密度与机制相似。细胞核变小、不规则，染色质浓缩、边集，呈断裂状，部分线粒体肿胀、空泡化。可见到典型的凋亡小体：圆形，可见从凋亡细胞脱落。位于凋亡细胞一侧，表面有完整的细胞膜包裹，小体内可见染色质碎片及破碎的内质网、囊泡化的线粒体等结构。③化疗组：结果与中药组相似，可见典型的凋亡小体。
4.2 酶细胞化学 ①Mg2+-ATP酶：光镜下可见对照组细胞Mg2+-ATP酶主要定位在细胞膜内侧，黑色酶反应颗粒大小均匀，密度大，呈线状规则排列，酶活性强。与正常组比较，中药组、西药组细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低。提示酶活性明显下降。②G-6-P酶：光镜下可见对照组细胞的G-6-P酶主要定位在细胞质内，酶反应颗粒粗大，排列密集，呈融合状，酶活性强。与对照组比较，中药组、西药组细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，西药组部分细胞为阴性。提示酶活性明显下降。 采用Tiger图像分析仪测定Mg2+-ATP酶和G-6-P酶阳性细胞平均光密度（AOD）值，与对照组相比，P＜0.01。
5 讨论
中药血清药理学方法是由日本学者于20世纪80年代首先提出来的。是给动物灌服中药一定时间后，取其血清进行实验的药理学研究方法。利用血清药理学方法，给大鼠灌服中药一定时间后，取出血清进行体外实验。能客观反映中药进入体内之后，经过消化、吸收、代谢等过程后发挥药效作用，中药血清药理学提示：中药复方诱导的肿瘤细胞株凋亡具有可靠性和可信性[2]。
本研究证实，4种不同中药复方的中药血清，均能诱导相应肝癌细胞株、A549人肺癌细胞株、CCL-229人大肠癌细胞株和SGC-7901胃癌细胞株发生凋亡，见到典型的形态学特征性指标――凋亡小体[3-4]。
Mg2+-ATP酶是质膜标志酶，主要定位于细胞膜内侧，此酶参与质膜上离子的主动转运，,维持细胞内K+和Na+浓度相对稳定状态,保持细胞膜内、外渗透压平衡以及参与保持细胞内外的化学梯度和跨膜电位，维持细胞内高钾低钠状态，从而保证细胞的活性。本实验中，药物血清作用后细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，提示酶活性明显下降。G-6-P酶是内质网标志酶，是一种多功能酶,是细胞内糖原异生作用中重要酶之一，被称为“代谢标志酶”之一。此酶在糖代谢、免疫球蛋白合成及其它蛋白质合成、浓缩、加工等方面发挥重要作用。本实验中，药物血清作用后细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，有的为阴性。提示酶活性明显下降[5-6]中药血清诱导肿瘤细胞凋亡，降低肿瘤细胞株酶活性可能是中药复方抗肿瘤的机理之一。笔者同样成功应用本中药血清药理学技术进行了胃癌宁对人SGC-7901胃癌细胞株p53、bcl-2基因表达影响的研究[7]。
（1）给药方案与采血时间。目前存在多种给药方案。但一般使用灌胃方式，也可通过皮肤、黏膜、呼吸道等途径给药。给药时间最短者为1天，最长者为10天；给药次数也各不相同，有每天2次的，也有每天3次的。尽管已有研究表明，连续用药5天和10天所制备的含药血清的生物学效应是相似的，但无论哪种给药方法都必须使药物浓度达到相对平衡状态。根据目前掌握的大量药物的有效成分的药代动力学数据，本实验采用与多数研究者一致的即时血清在实验前禁食12h，次日采用两次给药方式（一次给药后2h等量给药），连续灌胃3天，日两次；采血时相，分别在末次给药后1、2、3h采血。证明是研究中药复方作用肿瘤细胞株较为可靠的血清药理学方法血清[8-9]。（2）含药血清用量。目前中药含药血清的浓度还没有确切的规定，选用5 、10 和20浓度的含药血清进行实验所得结果的说法不一，进行细胞增殖抑制作用的实验采用高浓度的效果好，而进行细胞增殖促进作用的实验采用低浓度的效果好[10]，本研究采用10的平均浓度进行实验，结果较好。当然，最佳血清浓度是因不同实验而异的，故最好的做法是通过预实验来确定。血清药理学可较好地克服了中药粗制剂直接进入体外实验的缺点，其结果的可信度明显优于中药粗制剂直接用于体外实验，不仅提示中药制剂在胃肠内处理过程中活性成分的转化与改变，而且有利于中药真正有效活性部位、有效成分的发现，将有助于促进中药药理现代化的发展，为新药开发奠定能基础。本研究进一步证实，血清药理学方法在诱导肿瘤细胞凋亡、降低酶活性等研究中的应用具有稳定性、可信性。血清药理学方法的应用将更多的相关中药方剂引入抗肿瘤细胞凋亡及诱导细胞凋亡方面的研究，筛选有效的中药成分与其有效组方来达到诱导大量肿瘤细胞凋亡，揭示中药的抗癌机理，为中药治疗肿瘤提供科学、客观和现代的手段与方法，是今后研究的重要内容，对人类攻克肿瘤有着重大意义。
参考文献
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