生物细胞作用篇1

目的研究马齿苋多糖对宫颈癌细胞恶性生物学行为的抑制作用。方法选择c57小鼠并建立宫颈癌荷瘤鼠模型，随机分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组4组，分别接受等渗盐水、100、200、400mg/kg马齿苋多糖腹腔注射。治疗后检测移植瘤的体积、重量以及移植瘤中细胞凋亡数目、ATP含量、新生血管分子的表达量。结果低剂量组、中剂量组和高剂量组的瘤体体积和重量、移植瘤组织中的ATP含量以及血管内皮生长因子(VEGF)、CD13、CD34的表达量均低于对照组，凋亡细胞数目多于对照组。马齿苋多糖能够以剂量依赖性的方式降低移植瘤的体积、重量以及移植瘤中细胞凋亡数目、ATP含量、新生血管血管分子的表达量，增加凋亡细胞的数目。结论马齿苋多糖能够抑制宫颈癌移植瘤的生长、诱导癌细胞凋亡、干扰氧化供能、减少新生血管数目，对宫颈癌细胞恶性生物学行为具有抑制作用。

［关键词］

宫颈癌;马齿苋多糖;凋亡;血管新生;三磷酸腺苷

宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤，HPV感染是宫颈癌及癌前病变的重要危险因素［1-2］。近年来，HPV感染率和宫颈癌的发病率呈上升趋势［3］。手术切除联合术后放化疗的综合治疗方式是临床治疗宫颈癌的主要方式，能够有效清除病灶并杀灭残留癌细胞，进而最大限度地预防肿瘤复发。化疗是术后综合治疗的重要组成部分，能够杀灭癌细胞，同时也会损伤正常组织，增加化疗药物剂量虽然能够增强对癌细胞的杀伤效应、但也会引起机体无法耐受的化疗损伤并影响化疗效果。近年来，天然植物中多糖成分的抗肿瘤活性受到了越来越多的重视，马齿苋多糖作为生物反应调节剂亦具有杀灭癌细胞的作用［4］。在本研究中，我们探讨了马齿苋多糖对宫颈癌细胞恶性生物学行为的抑制作用。

1材料与方法

1．1实验材料c57小鼠32只由浙江大学实验动物中心提供［实验动物许可证号:SCXK(沪)2015-0107］，均为雌性、周龄4～6周、体重18～25g。马齿苋多糖由浙江省立同德医院药剂科提取和分离，TUNEL试剂盒购自Roche公司，ATP检测试剂盒和蛋白浓度BCA测定试剂盒购自碧云天公司，血管内皮生长因子(VEGF)、CD13、CD34以及β-actin单克隆抗体购自Abcam公司;荧光显微镜为Nikon公司产品，电化学显影仪为天能公司产品。

1．2实验方法

1．2．1宫颈癌荷瘤鼠模型的制作方法取SiHa细胞株(购自中科院上海分院)，常规复苏、培养、传代后得到对数期生长细胞，用培养基将细胞浓度稀释至1×107/ml，取细胞悬液100μL注射入小鼠背部的皮下组织。待肿瘤生长、瘤体形成后，用影像学检查测定瘤体体积，筛选瘤体直径1．2～1．6cm的小鼠作为宫颈癌荷瘤鼠模型。

1．2．2动物分组及药物治疗方法宫颈癌荷瘤鼠模型制作成功后，将模型小鼠随机分为对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组4组，每组8只，分别接受等渗盐水、100、200、400mg/kg马齿苋多糖腹腔注射，每日给药1次，连续治疗12d。

1．2．3瘤体体积及重量处死小鼠后，分离皮下肿瘤组织，测定瘤体的体积和重量。

1．2．4瘤体内细胞凋亡情况取移植瘤组织充分研磨，用TUNEL试剂盒检测瘤体内细胞凋亡情况，分别用TUNEL试剂和DAPI试剂对凋亡细胞以及细胞核染色，然后在荧光显微镜下观察4～6个随机视野内的200个细胞，计算凋亡细胞的数目。

1．2．5肿瘤组织ATP生成能量取移植瘤组织充分研磨，参照试剂盒说明书检测ATP含量。同时，用BCA试剂盒计算待测样本中的蛋白总含量，以总蛋白含量为内参照计算每mg蛋白内ATP的含量。

1．2．6免疫印迹检测取移植瘤标本，加入RIPA蛋白裂解液后匀浆、离心后取上层蛋白样本，加入上样缓冲液后于100℃高温变性10min。取变性后的蛋白标本适量，加入预先配置好的SDS-PAGE凝胶中，依次进行垂直电泳、电转膜、抗原位点封闭、第一抗体孵育、第二抗体孵育以及电化学发光(electrochemilu-minescence，ECL)显影。孵育的抗体包括VEGF、CD13、CD34以及β-actin。得到蛋白条带后计算灰度值，以β-actin为内参照对蛋白含量进行半定量分析。

1．3统计学处理采用SPSS21．0软件进行统计学分析，计量资料用均数±标准差(x珋±s)表示，组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。定性资料以率(%)表示，组间比较采用χ2检验。P＜0．05为差异有统计学意义。

2结果

2．1瘤体体积及重量低剂量组、中剂量组和高剂量组的瘤体体积及重量均低于对照组。马齿苋多糖能够以剂量依赖性方式降低瘤体体积及重量，高剂量组的瘤体体积及重量均低于低剂量组、中剂量组，中剂量组的瘤体体积及重量均于低剂量组。见表1(P均＜0．05)。

2．2瘤体内凋亡细胞数目低、中和高剂量组肿瘤组织中的瘤体内凋亡细胞数目均高于对照组。马齿苋多糖能够以剂量依赖性的方式增加瘤体内凋亡细胞数目，高剂量组肿瘤组织中的瘤体内凋亡细胞数目均高于低剂量组、中剂量组，中剂量组肿瘤组织中的瘤体内凋亡细胞数目均高于低剂量组。见表2。

2．3血管新生分子的蛋白含量低剂量组、中剂量组和高剂量组肿瘤组织中的VEGF、CD13、CD34的蛋白含量低于对照组，马齿苋多糖能够以剂量依赖性的方式降低肿瘤组织中的VEGF、CD13、CD34蛋白含量，高剂量组肿瘤组织中的VEGF、CD13、CD34的蛋白含量低于低剂量组、中剂量组，中剂量组肿瘤组织中的VEGF、CD13、CD34的蛋白含量均于低剂量组。见表3。

2．4ATP含量低剂量组、中剂量组和高剂量组肿瘤组织中的ATP含量均低于对照组，马齿苋多糖能够以剂量依赖性的方式降低肿瘤组织中的ATP含量，高剂量组肿瘤组织中的ATP含量均低于低剂量组、中剂量组，中剂量组肿瘤组织中的ATP含量均低于低剂量组。见表4。

3讨论

化疗是宫颈癌综合治疗方案的重要组成部分，化疗药物的毒副作用较强，虽然能够有效杀伤肿瘤细胞，但也会对正常组织造成较为严重的损伤。在临床实践中，使用化疗药物治疗宫颈癌时，提高化疗药物剂量、增加不同作用机制的化疗药物种类能够增强化疗药物对癌细胞的杀伤效应，但同时也加重正常组织的损伤，若患者无法耐受，会影响化疗效果［5］。近年来，许多研究报道从多种植物中提取的多糖类物质具有抗肿瘤活性。植物多糖一般不通过直接杀伤肿瘤细胞来发挥抗肿瘤效应，而是作为生物反应调节剂来增强体内的免疫应答和凋亡途径、氧化呼吸功能途径等来杀伤癌细胞［6］。因此，植物多糖对正常组织的损伤较小，筛选具有宫颈癌细胞杀伤效应的植物多糖并与常规化疗药物联合应用能够改善宫颈癌的治疗效果。

马齿苋是我国资源储备极为丰富的一类药食两用植物，其主要功效为清热解毒、凉血消肿，对于腹泻、痢疾、感染等疾病具有治疗作用［7］。马齿苋所包含的有效化学成分包括多糖、黄酮类、萜类、生物碱以及香豆素类等。该植物的粗提物具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎等多种活性，进一步的分离纯化发现，马齿苋中的多糖成分具有抗肿瘤效应。赵蕊等［8-9］的研究显示，马齿苋多糖能够增强宫颈癌荷瘤鼠的免疫功能、降低肿瘤细胞发生免疫逃逸的风险，进而使荷瘤鼠的肿瘤体积明显缩小。该研究提示马齿苋多糖具有抗肿瘤活性，能够有效抑制宫颈癌移植瘤的生长。

目前关于马齿苋多糖抗肿瘤效应的研究报道较少，为了进一步明确马齿苋多糖对宫颈癌的杀伤和抑制效应及生物学机制，我们建立了宫颈癌荷瘤鼠模型，通过腹腔注射不同浓度马齿苋多糖进行治疗。我们对移植瘤的生长情况进行了初步分析，对肿瘤体积的测量结果可知，马齿苋多糖能够以剂量依赖性的方式降低瘤体体积及重量，马齿苋多糖的浓度越高，瘤体的体积和重量越低。这部分结果与赵蕊等［8-9］的研究结果相吻合，说明马齿苋多糖能够抑制宫颈癌移植瘤的生长。在得到马齿苋多糖抑制肿瘤生长的结果后，我们进一步分析了肿瘤组织中癌细胞相关的恶性生物学行为。在宫颈癌的发生和发生过程中，宫颈上皮的表型发生变化，多种抑癌基因失活、原癌基因激活、细胞周期蛋白和抗凋亡分子表达增加会使得宫颈上皮由正常表型向恶性增殖表型转化，表现为极强的增殖能力和抗凋亡能力［10］。化疗药物和植物多糖发挥抗肿瘤效应的根本途径就是通过不同机制来诱导癌细胞发生凋亡［11］。本研究发现，马齿苋多糖能够以剂量依赖性的方式增加瘤体内凋亡细胞数目。说明马齿苋多糖能够诱导宫颈癌移植瘤组织中的癌细胞发生凋亡。

生物细胞作用篇2

【关键词】 骨髓细胞；成骨细胞；生长物质；组织工程

0引言

骨骼损伤、肿瘤等导致的骨缺损是骨科每天都要面临的问题，临床医生通常是通过自体或异体骨移植方法来解决缺损问题，但这种方法存在着来源有限、增加创伤、排斥反应及疾病传播等问题. 由于利用组织工程学原理与方法再生的骨组织植入体内无免疫排斥的危险且来源充足，因此它的优势逐渐得到认同［1］ . 近年来，组织工程迅猛发展并且是目前公认的最有可能在临床取得实际效益的研究领域之一［2］. 但是要真正广泛应用于临床，还必须解决好组织工程的三大关键问题即种子细胞、可降解的生物支架及生长因子. 骨髓来源的骨髓基质干细胞(marrow stromal stem cells， MSCs)由于取材容易，易于体外培养和诱导，是目前最有前途成为组织工程种子细胞来源的细胞［3-4］. 组织工程是将细胞与材料复合，从而构建植入人体的活材料. 在此过程中，目的细胞的生长调控是十分重要的一环，因此对生长因子的作用及其机制的研究是组织工程的重要内容. 生长因子是通过细胞间信号传递影响细胞活动的一类多肽因子，它对细胞具有促进或抑制其分裂增殖、迁移和基因表达的作用. 生长因子对目的细胞作用有利于在体外构建与体内更为相似的模拟环境，从而为体内试验奠定基础.

1骨髓基质干细胞及成骨诱导

目前，骨组织工程种子细胞的分离主要有三种来源：骨髓来源、骨膜来源和松质骨来源［5］. 种子细胞的培养是骨组织工程的前提与基础. MSCs 由于其强大的增殖能力与多向分化潜能成为骨组织工程的种子细胞之一［6］.

骨髓是由造血系统和基质系统组成的复合组织，它除了是造血干细胞的主要来源外，同时成人的骨髓组织中还存在着骨髓间质干细胞. 20世纪70年代中期，Friedenstein等［7］报道，骨髓标本中小部分贴附细胞在培养过程中能够分化形成类似骨或软骨的集落，这部分贴壁的细胞就是骨髓基质干细胞，也叫间质干细胞. 这种间质干细胞具有多方向的分化潜能，可以分化成为骨、软骨、肌肉、韧带、肌腱和脂肪等组织［8-9］. 间质干细胞的多向分化特性使之成为组织工程的理想细胞来源，是目前骨组织工程普遍选用的细胞. 近年来的许多组织工程研究均采用了人或动物的骨髓间质干细胞，其结果十分令人满意［10-11］.

现有的MSCs培养方法主要为应用诱导剂 (地塞米松、β甘油磷酸钠、抗坏血酸) 和生长因子进行诱导，但诱导效果均不甚理想. 国内外研究者发现， MSCs的分化具有位点特异性，即在何种微环境中培养MSCs，就倾向于向这类环境中的细胞分化. 根据MSCs分化的位点特异性，在骨组织工程中欲把MSCs诱导分化为成骨细胞，采用模拟成骨微环境来诱导MSCs的增殖与成骨分化可能也是一种有效的诱导方法［12-13］.

2骨组织工程相关因子

生长因子的合理应用对构建骨组织工程起着关键的作用. 骨组织拥有一个庞大的生长因子库，目前在骨组织中发现了十几种生长因子，已经发现有多种细胞因子对成骨过程具有重要的调节作用，可以诱导成骨、促进细胞增殖和胶原合成、促进成骨和血管生长以及在骨吸收改建方面发挥作用，因此在构建组织工程骨时对成骨因子合理使用或调控成骨细胞的适时适量表达十分重要.

2.1血管内皮生长因子VEGF又称血管通透因子(VPF)或（VAS），是近年来发现的一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，对胚胎发育及切口修复等生理功能有重要意义. VEGF是一种糖蛋白，其相对分子量为34~45 ku由两个相对分子量各为17 ~22 ku的不同亚单位组成的二聚体，VEGF就是由于该基因的剪切方式不同所形成的系列产物. 人至少有4种VEGF，分别为VEGF121， VEGF165， VEGF189和VEGF206. 近年来研究表明，血管内皮生长因子对中胚层细胞分化有作用，可以使骨髓基质干细胞向成骨分化. Midy等［14］发现，外源性VEGF能使体外培养的成骨细胞碱性磷酸酶(ALP) 活性及cAMP浓度提高4倍. VEGF诱导成骨细胞迁移，增加ALP活性，同时成骨细胞自身合成VEGF. PGE1， PGE2， 1， 25(OH)维生素D3及IGFⅠ能增加成骨细胞VEGF mRNA的表达.

2.2肿瘤坏死因子TNF是一种糖蛋白的低聚物，分子量为39~70 ku，是多功能的细胞因子，主要由活化的巨噬细胞和T细胞产生. TNF是迄今为止所发现的直接杀伤肿瘤细胞作用最强的生物活性因子之一. TNF分两大类：由活化的巨噬细胞产生的称为TNFα，由活化的T细胞产生的TNF称为TNFβ，它们共同作用于同一受体. TNF可刺激培养的成骨细胞和骨器官合成RNA和PGE2，TNF可以抑制胶原和骨钙素的合成以及1， 25(OH)维生素D3刺激的ALP活性，但它可刺激Ι型胶原mRNA表达，这说明TNF的这种胶原合成抑制作用受翻译后产物的调节［15］.

2.3骨形成蛋白BMP是广泛存在于骨基质中的一种酸性糖蛋白，是目前唯一被确认具有异位成骨能力的生长因子，它能在体内、外诱导骨髓基质细胞转化为成骨细胞，使高分化的骨细胞群体数量保持稳定. Okubo等［16］用支架材料与不同剂量的BMP复合后植入兔下颌骨的骨缺损中，3 wk后ALP和组织学检查发现新骨形成，证实BMP诱导成骨系软骨内化骨形成过程，且成骨量随BMP剂量增加而增加，有明显的剂量依赖性. 陈克明等［17］认为： BMP与纤维蛋白制成的复合物，具有良好的骨诱导活性. 载体包容BMP等诱导因子可有效缓慢的释放，以发挥其诱导作用. 余家阔等［18］认为，在BMP诱导下，无论是幼稚软骨细胞还是成熟软骨细胞都有表达成骨细胞表型的趋势. 目前认为BMP是骨组织工程中促进成骨作用最重要的一种，近年来BMP作为一种有价值的生长因子越来越受到人们的重视，然而其诱导成骨的机制目前却并不完全清楚. 但由于BMP在骨组织中含量极少且在体内扩散很快，容易被蛋白酶所分解，因而不能在局部发挥持续刺激和诱导成骨作用，其诱导活性难以得到充分的发挥［19］.

2.4转移生长因子TGFβ是一种有多种功能的单链多肽，分子量为25ku，具有对骨组织、结缔组织及免疫系统等细胞的调节功能，其调节作用包括细胞生长调节和分化诱导两方面. 目前发现有5种亚型，分别为TGFβ1~TGFβ5. TGFβ广泛存在于多种组织及转化细胞中，其中以骨组织、血小板、软骨组织中含量最丰富，而TGFβ受体在成骨细胞表达最多，表明TGFβ的主要作用是调节骨代谢. 有实验表明TGFβ对胶原基因表达和胶原的合成具有促进作用. TGFβ可促进细胞增殖与分化，促进细胞外基质合成，也是多种免疫细胞的自分泌或旁分泌的调节因子［20］.

TGFβ为主要成骨因子之一，它诱导间充质细胞合成软骨特异性蛋白聚糖和Ⅱ型胶原，刺激成骨细胞的增殖及胶原合成. TGFβ在体外对成骨细胞的作用很复杂，部分取决于TGFβ的浓度、细胞密度、种系和成骨细胞的分化阶段. 多数研究认为TGFβ能抑制成骨细胞游离钙的合成、增加成骨细胞分化以及成骨细胞胶原和ALP的表达. TGFβ对成骨细胞生长有调控作用，这种作用在一定程度上表现为双相性. 研究表明，含血清培养的成骨细胞，低浓度的TGFβ可以刺激细胞DNA和胶原合成，抑制ALP活性，刺激细胞生长；而高浓度则抑制胶原合成，对DNA合成无作用. 无血清培养的成骨细胞，高浓度TGFβ抑制ALP生成. 此外，也有研究表明，TGFβ促进骨髓源性和骨膜源性骨前体细胞趋化到骨软骨损伤部位，进而增生、分化形成成骨细胞和软骨细胞 ［21］.

2.5成纤维细胞生长因子FGF是一种对中胚层和神经外胚层细胞具有促有丝分裂作用的多肽生长因子. 它对成骨细胞具有促增殖作用，并且通过增殖骨细胞数目促进骨形成. FGF分为酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和碱性成纤维细胞生长因(bFGF)两种. aFGF存在于骨细胞浸出物中，bFGF存在于牛和人的骨骼中，前者较后者低10倍. FGF是毛细血管增殖刺激剂，能够促进毛细血管向断端内以及骨移植物中长入，使骨修复早期的组织中软骨岛数量增加，并使骨折断端骨痂血管重建的时间提前，而且可以增加BMP的成骨量. 目前虽然FGF的作用机制还不是很清楚，但是可以肯定的是局部和全身应用FGF可以促进骨形成. bFGF是一种内源性多肽生长因子，有试验表明它能有促进中胚层和神经外胚层细胞有丝分裂的作用 ［22］.

2．6血小板源性生长因子PDGF 首先在血小板中发现，分子量为28～35 ku，由两个多肽键A和B组成异二聚体，在体外具有促进纤维细胞生长的作用，对所有起源于间叶细胞包括成骨细胞既能促进骨形成，又能刺激骨吸收，起双向调节作用［23］. PDGF还对中胚层细胞有促有丝分裂作用，它对人和鼠成骨细胞及其细胞系均有促有丝分裂作用. 同时它还是一个强力趋化因子，对人和鼠组织中的成骨细胞有强烈的趋化作用. PDGF 是由血小板、巨噬细胞和骨细胞合成，贮存于骨基质中. 它在创伤愈合中起重要作用，称为“创伤因子”. 其主要功能是诱导成骨细胞和骨祖细胞分裂，对于培养的成骨细胞有强烈的趋化作用，能刺激胶原合成. Canalis等［24］发现: PDGF有与IGFⅠ同样的作用，能刺激鼠骨DNA及胶原合成，但是PDGF也具有促使胶原降解的性能.

2．7类胰岛素生长因子IGF家族由两种相关多肽组成，即IGFⅠ和IGFⅡ. 它们是骨基质中最富含的生长因子，两者有相似的结构和体外作用，但在体内生物学效应不同. IGFI 在细胞增殖及细胞外基质合成代谢中具有重要作用. Throp等［25］研究证实了IGFⅠ和TGFβ具有相互作用以促进细胞增殖、胶原及蛋白聚糖合成的作用.

IGFⅡ是重要的细胞内调节剂，能刺激骨细胞的增生、增加骨细胞的分化和I型胶原合成. Strong等［26］发现IGFⅡ能在正常人骨细胞培养中24 h 内增加原胶原mRNA 2～4 倍.

综上所述，细胞因子不过是众多因子中研究较为成熟的几个，如何把这些因子的作用应用于组织工程中，才是我们研究生长因子的目的. 什么样的方法才能使细胞因子的活性在组织工程中发挥最好的作用还要进一步探讨.

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生物细胞作用篇3

【关键词】  半边旗； 5f； ncih460； 生长抑制

inhibitory effects of  5f from pteris semiinnata  l. on proliferation of nonsmall cell lung cancer ncih460 cells

    liu yi1，wu kefeng1，li li1，george g chen2，michael ky hsin2，malcolm j underwood2，liang lianci1，3

    1. guangdong key laboratory for research and development of nature drugs，guangdong medical college， zhanjiang 524023，china；2. department of surgery，the chinese university of   hongkong，prince of wales hospital，shatin，n.t.；3.institute of biochemistry and molecular biology，guangdong medical college

    corresponding authors：liang lianci，email：plliu78@sina.comabstract：objective   to investigate inhibitory effects of 5f from pteris semiinnata l. on proliferation of nonsmall cell lung cancer ncih460 cells. methods  ncih460 cell growth inhibition mediated by 5f was detected by mtt. pihoechst double staining and tunel assay  were used to observe cell  apoptosis. flow cytometer was used to determine the effect of 5f on the content of dna in cells. results  5f displayed growth inhibitory activity against ncih460 cells with ic50 values of  21.40,4.52 and 1.02 μg/ml   at the  point  of   24, 48 and 72 hours. 5f could induce apoptosis. ncih460 cells treated by 5f were arrestet   in g2/m. conclusion  in vitro 5f  significantly   inhibited  the proliferation of ncih460 cells and the activity might   be realized through   inducing apoptosis.

    key words：pteris semiinnata l;  5f;  ncih460;  proliferation inhibited

半边旗（pteris semiinnata l.）是生长在我国南方的传统中草药，民间用其来治疗感染性疾病。从半边旗中分离提取到一些具有生物活性的物质，以5f含量最高，其结构为二萜类化合物，见图1。化学结构名为11α羟基15氧16烯对映贝壳杉烷19酸（ent11αhydroxy15oxokaur 16en19oic acid）。本课题研究表明5f在体外能抑制多种癌细胞的生长并诱导凋亡的发生；能明显减小k562、s180等瘤株在小鼠所形成的肿瘤大小，延长小鼠存活时间[13]。

    肺癌是目前全世界人类最主要的癌症死因之一，其中75%～80%为非小细胞肺癌（nsnlc）， 晚期肺癌患者仅有2%存活率超过5年，通常不满1年。近年来，对肺癌患者的治疗还是以化疗和放疗为主导，这些治疗药物和措施会给患者带来极大的痛苦，因此，从天然植物中提取具有抑制肺癌细胞生长的高效低毒的化合物已经成为抗肿瘤研究的热点。本研究旨在探讨5f对非小细胞肺癌ncih460细胞生长的抑制作用及可能的机制。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    从植物半边旗中提取的5f，纯度为100%，使用前溶于dmso。

    mtt、hoechst33342、pi为sigma公司产品；超级无支原体新生牛血清购自杭州四季青生物材料有限公司；rpmi1640购自美国hyclone公司；胰酶购自美国gibco公司；细胞凋亡检测试剂盒为武汉博士德生物工程有限公司产品；其余试剂均为国产分析纯。

    非小细胞肺癌nci－h460细胞由本室传代。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养

    ncih460细胞培养于含10%小牛血清，100ku/l青霉素和100mg/l链霉素的rpmi1640培养液中，37℃、5%  co2饱和湿度细胞培养箱培养。取对数生长期细胞用于实验。

    1.2.2  mtt法检测5f对ncih460细胞的生长抑制作用

    取对数生长期的ncih460细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，rpmi1640完全培养液调制成2.0×104/ml细胞悬液，接种于96孔板中，每孔接种100μl（含2.0×103个细胞）。培养过夜后，吸出培养液，加入新培养液90μl及不同浓度的5f药液10μl，使终浓度分别为5、10、20、40、80μg/ml。同时设置adm阳性对照组，空白对照组加入相同体积的培养液，每一浓度设8个平行孔。继续培养24、48、72h。每孔加入mtt(5g/l)20μl，继续培养4～6h。每孔加入dmso 100μl。在微型振荡器上摇匀15min，结晶溶解后，立即比色，用elx800型酶标仪在主波长为570nm，参比波长为630处测量od值，比色以空白孔调零。实验重复3次。

    抑制率=（1-实验组8孔od值平均值/对照组8孔od值平均值）×100%。

    bliss方法计算半数抑制浓度ic50。

    1.2.3  荧光显微镜观察细胞形态

    取对数生长期细胞， 调整细胞浓度为2.0×105/ml， 加1ml到预先放置盖玻片的6孔板中， 24h待细胞爬片后， 加入不同浓度的5f药液， 使其终浓度为5、 10、 20μg/ml， 继续培养24h后， 用预冷的pbs洗涤2次， 加入hoechst33342  37℃染色15min， pbs洗涤2次， 再加入pi染色液于冰上染色15min,  pbs洗涤2次,于荧光显微镜下观察并拍照。

    1.2.4  流式细胞仪检测dna含量的变化

    参照文献介绍的方法略加改进，1 000r/min, 离心5min收集药物处理组和对照组细胞，pbs洗涤2次，体积分数为70%的乙醇-20℃固定24h以上，pbs离心洗去乙醇后加pi染液(含50mg/l  pi，10mg/l  rnasea，0.1% tritonx100,  0.1%柠檬酸钠和0.5%nacl),室温下避光染色30min，400目筛网过滤,用epicsxl型(美国)流式细胞仪检测dna含量，实验重复3次。

    1.2.5  细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡

    取对数生长期细胞，调整细胞浓度为2.0×105个/ml，加1ml到预先放置盖玻片的6孔板中，24h待细胞爬片后，加入不同浓度的5f药液，使其终浓度为5、10、20μg/ml，继续培养24h后，用4%多聚甲醛／0.01m pbs室温下固定60min，余下步骤按试剂盒说明书进行操作。

    2  结果

    2.1  5f对ncih460细胞生长的抑制作用

    从表1和图2的结果可以看出，5f能明显抑制ncih460细胞的生长，其效果与时间和浓度相关。5、10、20、40、80μg/ml的5f在作用细胞48h后效果与阳性对照药adm相近。5f作用ncih460细胞24、48、72h的ic50分别为：21.40、4.52、1.02μg/ml。

    2.2  荧光显微镜观察5f对ncih460细胞的影响

    经pihoechst双染的ncih460细胞， 对照组细胞核大小较均一， 呈圆形或椭圆形， 染色质分布均匀， 此外光下显蓝色荧光， 出现个别坏死细胞， 见图3a。 而经5f处理24h后的ncih460细胞细胞形态则出现不同程度皱缩， 变形， 染色质浓缩， 部分细胞核染色体碎裂， 并有凋亡小体出现， 见图3b～d。 且细胞凋亡形态出现的多少与5f的浓度相关。

    2.3  流式细胞仪检测细胞dna的变化

    5f作用细胞24、48h后ncih460细胞的dna含量发生变化。随着5f作用终浓度的增加（5～40μg/ml），g0/g1期dna出现含量降低，s期表1  5f对ncih460细胞的生长抑制作用表2  5f处理ncih460细胞不同时相dna含量的影响变化不明显，g2/m显著增加。提示5f可以将ncih460细胞阻滞在g2/m期，见表2。

    2.4  tunel法检测5f对ncih460细胞凋亡的影响

    tunel法检测显示正常对照细胞不显深棕黄色,而经5f处理后的细胞胞核呈深棕黄色，表现为形态皱缩,核固缩,凝集成块，并形成凋亡小体，其凋亡数与5f剂量呈正相关，见图4。

    3  讨论

    临床上用于治疗肿瘤的热疗、放疗、化疗及生物疗法一直被用于杀死肿瘤细胞，随着肿瘤的治疗正朝着日益完善的综合治疗方向迈进，尤其近十几年迅速发展的生物治疗给人们带来了新的希望，但目前化学药物治疗在临床上依然起着重要作用。由于化疗药物的毒副作用及易产生耐药性等缺陷，从天然产物中筛选新的高效低毒的抗肿瘤药仍然是当务之急。本课题对半边旗的有效活性成分及提取工艺进行了详细的研究[46]，多年的实验证实其二萜类提取物5f 在体外可致人的多种癌细胞死亡，主要作用机制是诱导肿瘤细胞凋亡并能抑制肿瘤细胞的迁移[79]。

    细胞凋亡(apoptosis)是细胞在其生长、发育过程中发生的一种复杂的生理和病理过程，对机体的正常发育和自身稳定起着极其重要的作用。凋亡细胞的特征是细胞体积缩小，随即与邻近细胞的连接丧失，彼此脱离，失去微绒毛，胞浆浓缩，内质网扩张呈泡状并与细胞膜融合，核染色质浓缩呈块、团，典型的为半月形，凝聚于核膜周边，核仁裂解，进而细胞膜内陷将细胞自行分割为多个具有完整膜性结构，内含各种细胞成分的凋亡小体。不少疾病(包括肿瘤)的发病与凋亡受抑制有关，许多抗癌药物都是通过最终触发肿瘤细胞凋亡通路达到治疗的目的[6]。大多数抗癌药物都可引起肿瘤细胞的凋亡，诱导细胞凋亡可能是抗癌药物发挥作用的共同通路，所以细胞凋亡成为评估抗癌药物作用能力的一项重要指标。

    细胞的生长增殖，24、48、72h的ic50分别为：21.40、4.52、1.02μg/ml，5f对其的生长抑制作用呈浓度－剂量及时间－剂量关系；荧光双染的结果显示经不同浓度的5f处理24h后的ncih460细胞细胞形态出现不同程度皱缩，变形，染色质浓缩，部分细胞核染色体碎裂，并伴有凋亡小体出现，细胞凋亡形态出现的数量与5f的作用浓度有关,这提示5f体外对ncih460的生长抑制作用可能与其诱导凋亡有关；流式细胞仪检测结果发现细胞被阻滞在g2/m期，但5f终浓度为40μg/ml时，细胞周期各时相均出现不同程度的改变，这可能与高浓度5f直接杀伤细胞，表现出细胞毒作用有关；进一步用tunel法进行凋亡检测证实了5f抑制ncih460生长的作用是由其诱导凋亡而产生的。提示5f具有诱导ncih460细胞凋亡的能力，是一种值得深入研究的新型抗肿瘤候选化合物。

【参考文献】

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［6］ 龚先玲，陈志红，梁念慈.高效液相色谱法分析测定半边旗中黄酮类化合物[j]. 时珍国医国药，2007, 18（5）：10281029.

［7］ 何太平，覃燕梅，莫丽儿，等. 半边旗二枯类化合物sf对高转移卵巢癌ho 8910pm细胞中癌相关基因表达的影响[j]. 中国药理学通报，2008， 24（1）：117122.

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生物细胞作用篇4

【关键词】 肺癌 细胞生长 苯并口恶嗪酮衍生物

【Abstract】 Objective To find the inhibition of BOD to human lung cancer cell growth.Methods After treating A549 cells with different concentrations of BOD ， light microscopy and MTT assay were used to determine morphological changes and cell viability respectively.Results BOD induced the cell shrinkage， and made some cells round. Cell viability decreased with raised concentrations and prolonged treatment of BOD.Conclusion BOD could inhibited A549 lung cancer cell growth.

【Key words】 lung cancer cell，cell growth，BOD

在当今工业化程度较高的国家中，肺癌死亡率居于各种恶性肿瘤之首位［1］。而其中，肺腺癌最常见，发病率最高［1，2］，所以，治疗肺腺癌对于降低肺癌死亡率极为关键。A549细胞系为人肺腺癌细胞系，是体外研究肺腺癌治疗的常用的良好模型［3，4］。因此，A549细胞常被作为一种可靠的模式细胞，用于体外筛选治疗肺腺癌的药物。目前，临床上常用的肺癌治疗药物有环磷酰胺、阿霉素、甲基苄肼、长春新碱、氨甲蝶呤、环已亚硝脲等。虽然上述药物可治疗肺腺癌，但是毒副作用较大，故存在抗药性问题。因此，需要不断开发治疗肺腺癌的新药物。

有研究报道，一些小分子化合物，如黄樟素氧化物［5］、吡唑羟基酯化合物［6］等，可以抑制A549细胞的生长，引起细胞凋亡，推测该类小分子化合物具有广谱性的抑制癌细胞增殖作用。本文对另一类新合成的小分子化合物苯并口恶嗪酮衍生物（BOD）对A549细胞生长的作用进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺腺癌A549细胞（军事医学科学院第五研究所馈赠），RPMI 1640培养液（美国GIBCOBRL公司），新生小牛血清（山东省医学科学院；杭州四季青生物工程材料有限公司），胰酶（上海生工）。小分子化合物BOD（1～5＃）用二甲基亚砜（DMSO）溶解。

1.2 细胞培养 人肺癌细胞A549的培养液为含10%小牛血清的RPMI 1640，消化液为0.25%胰蛋白酶加0.02 mol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(1∶1，V∶V)。置于37 ℃，5% CO2 饱和湿度的培养箱中培养。实验中选用对数生长期细胞。

1.3 实验分组 根据加入的BOD药物浓度不同将细胞分组：①对照组；②溶剂对照组（DMSO）；③加药组（分别为50 μM、100 μM、200 μM）。将各组细胞接种到24孔和96孔板中，每孔细胞浓度为1×104/ml，置于37 ℃，5% CO2 饱和湿度的培养箱中培养24 h后加药，分别于加药后24 h和48 h进行观察和分析。

1.4 细胞形态学观察 各组细胞加药24 h和48 h后，倒置相差显微镜下观察24和48 h细胞形态变化。

1.5 MTT法检测细胞琥珀酸脱氢酶的活性 将上述培养于96孔板中的细胞根据实验分组加入不同浓度的BOD，于各组药物处理终止前4 h每孔加入5 mg/ml MTT液20 μl，继续培养4 h，然后小心吸出各孔内培养液，加入100 μl DMSO，振荡至结晶全部溶解，酶标仪上570 nm测定光密度（OD值）。取各平行孔OD值的平均值，根据下式计算细胞相对存活率: 存活细胞(%) = (实验组OD 值/对照组OD 值)×100%(以不含细胞的培养液为空白组调零)。

1.6 统计学处理 实验数据以x±s表示，经t检验，P＜0.05 表示有统计学意义。

2 结果

2.1 BOD对A549细胞形态学影响 A549 细胞经BOD（1～5#，表1）(200 μM)处理24 h后，在倒置显微镜下可见细胞明显缩小，有的细胞变圆，而且细胞的生长均受到抑制，其中BOD 2#、3#和5#处理组的抑制作用尤其明显（图1)。 表1 BOD 1～5# 化合物序号

2.2 BOD对A549细胞存活率的影响 观察到细胞形态发生了明显变化之后，为了进一步证明BOD对A549细胞生长的抑制作用，我们用MTT法检测A：对照组；B：BOD 1＃处理组；C：BOD 2＃处理组；了各组BOD处理后琥珀酸脱氢酶的活性变化，发现BOD对A549细胞的影响呈浓度和时间依赖性关系。随药物浓度的增加，细胞存活率降低；随药物处理时间的延长，细胞存活率也降低。其中BOD 2＃、3＃和5＃处理组细胞存活率降低尤其明显，这与形态观察结果一致（表2）。表2 BOD1～5＃化合物对A549细胞存活率的影响注：与溶剂对照组相比*P＜0.05，P＜0.01，n=3

3 讨论

化学遗传学（chemical genetics）是紧密连接化学、生物与医药领域的桥梁。基于传统遗传学筛选原理，化学遗传学方法是利用细胞渗透性的生物活性小分子，直接特异性地与靶分子（蛋白质或核酸）相结合，实时性激活或抑制靶分子功能，由此鉴定在生物学过程中起调节作用的蛋白质或基因，并了解其作用分子机制，也可由此找到有医药价值的小分子［7，8］。化学遗传学的手段是可控的和可逆的，可以随时加入或除去小分子化合物，从而启动或中断特定的反应。大多数小分子化合物对蛋白质的作用非常快，从而可以进行实时检测。此外，通过控制化合物的浓度，可以对其作用的靶分子的动力学过程进行分析。而且一个同样的小分子化合物，可以被广泛地用于影响各种不同生物体的某一种过程或功能。因此，化学遗传学为创新药物的研究提供了新机遇。已有研究报道，一些小分子化合物可以通过抑制癌细胞的生长及引起癌细胞凋亡而起到抗癌作用［9］。

一些小分子化合物，如黄樟素氧化物、吡唑羟基酯化合物等，可以明显的抑制A549细胞的生长，引起细胞凋亡或坏死。本文的研究结果表明，新合成的5种小分子化合物——BOD，随着浓度的增加和作用时间的延长，细胞存活率逐渐降低，尤以2＃、3＃和5＃化合物作用最为明显；细胞形态学研究结果证明，在BOD作用下，A549细胞明显缩小，细胞密度较对照组明显降低。证明BOD能有效地抑制A549细胞的生长，在一定程度上抑制了肿瘤的恶性程度，可为治疗肿瘤提供一定的理论依据。这一研究结果也为我们下一步的工作，如寻找此化合物作用的靶蛋白，进一步研究其控制细胞增殖、分化的分子机制奠定基础。

【参考文献】

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生物细胞作用篇5

[关键词]纳米羟磷灰石-脂肪族聚酯酰胺；成骨细胞；生物相容性

[中图分类号]R 783.1[文献标志码]A[doi]10.3969/j.issn.1673-5749.2012.01.009

Biological effects of nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite on the osteoblastsDeng Xia1, Xia Xi2.（1. Dept. of Stomatology, Nuclear of Industry 416 Hospital, Chengdu 610051, China; 2. Dept. of Prosthodontics, The Affiliated Hospital of Stomatology, Chongqing Medical University, Chongqing 400015, China）

[Abstract]ObjectiveTo evaluate the biological effects of nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite（nHA-PEA）on the osteoblast.MethodsThe Dulbecco minimum essential medium（DMEM）leaching liquor of nHA-PEA was applied to the osteoblasts of the test groups while the DMEM itself was applied to control. The methyl thiazolyl tetrazolium assay, flow cytometry and alkaline phosphatase（AKP）analysis were used to evaluate the changes in cell growth, cell cycle and cell function. Moreover, osteoblasts were cultured on the surface of nHA-PEA composite and the attachment, growth and proliferation of osteoblast were investigated. Results The cultured osteoblasts grew well and showed nomorphological variation. Osteoblasts of different test groups demonstrated relative proliferation rate ranging from 92%～107% without dose-dependent effect（P>0.05）. The cell cycle and AKP activity were similar in test and control groups（P>0.05）. Good cell attachment and proliferation manner were observed on the membranes. ConclusionnHA-PEA has no negative effects on the osteoblast and its osteoblastcompatibility is proved.

[Key words]nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester-amide composite；osteoblast；biocompatibility

有机-无机复合生物材料是组织工程学研究的热点[1]，该材料主要用于修复和重建人体的硬组织。纳米羟磷灰石-脂肪族聚酯酰胺（nano-hydroxyapatite-aliphatic polyester -amide composite，nHA-PEA）复合材料由nHA粒子与PEA均匀混合制得，其中羟磷灰石（hydroxyapatite，HA）是人体骨、牙等无机组织的主要成分，PEA及其共聚物是一类新型的生物可降解高分子材料[2]。nHA- PEA复合材料兼具了有机物的韧性和无机物的刚性，具有良好的理化性能。本研究将nHA-PEA复合材料作用于体外培养的成骨细胞，检测其对细胞生长、增殖能力、细胞周期、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）活性的影响，观察细胞在其表面的黏附、铺展形态，评价其对骨细胞的相容性和生物活性。

1材料和方法

1.1主要材料和仪器

达尔贝科极限必需培养液（Dulbecco minimum

essential medium，DMEM）、胰蛋白酶（Gibco公司，美国），新生小牛血清（成都哈里生物工程有限公司），甲噻唑四唑氮（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）试剂（Sigma公司，美国），AKP试剂盒（北京柏定生物工程有限公司）。Sanyomco-17AI二氧化碳孵箱（Sanyo公司，日本），Olympus IX50相差倒置显微镜（Olympus公司，日本），JSM-5900LV型扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM；JEOL公司，日本），可见光高效分析仪/HTS 7000plus多孔板紫外/荧光（PE公司，美国），流式细胞计数（flow cytometry，FCM；Coulter公司，美国），LightCycler检测仪（Roche公司，德国）。1.2浸提液制备

按文献[3]制得4组nHA-PEA复合材料，按其无机和有机成分的质量分数分组，分别为A组0和100%，B组10%和90%，C组20%和80%，D组30%和70%。将4组nHA-PEA复合材料（平均厚度0.5～1 mm）消毒灭菌后，按照国际标准化组织ISO 10993-5医疗器械生物学评价标准所推荐的试样表面积和浸提介质为6 cm2·mL－1的比例[4]，置37℃滤除细菌的培养液中，浸提3～4 d的浸提液备用。

1.3成骨细胞培养和细胞悬液的制备

取生长稳定的第4代SD乳鼠颅骨成骨细胞，经质量分数0.25%的胰酶消化后行细胞计数，用DMEM配制5×104个每毫升的细胞悬液。

1.4甲噻唑四唑氮比色

将200μL密度为5×104个每毫升的细胞悬液加入96孔板，置于体积分数5%的二氧化碳培养箱，37℃培养24 h，细胞贴壁后弃掉原有培养液，将细胞分为试验组（A～D）和对照组（E），试验组每组均分别加入200、100、50μL终质量分数分别为100%、50%和25%的浸提液，形成A1、

A2、A3，B1、B2、B3，C1、C2、C3，D1、D2、D3，

对照组加入原培养液。每日于相差显微镜下观察细胞形态，生长和增殖情况。分别于第1、3、5、7 d各取96孔板1块，每孔加入20μL的MTT，孵育4 h，每孔加入200μL二甲基亚砜，振荡1 min，混匀，570 nm波长下测定各孔吸光度（A），取3孔均值，计算细胞增殖率（proliferation rate，RP）：RP=（A试验组/A对照组）×100%。1.5流式细胞计数

接种对数生长期的成骨细胞1×105个每毫升瓶，细胞贴壁后A～D组弃原培养液加入质量分数均为100%的复合材料浸提液，E组加入新鲜原培养液，标准环境下3 d换液1次，培养7 d，消化、离心并收集沉淀细胞。流式细胞计数DNA荧光强度及散光参数，Multicycle软件分析细胞的周期分布和程序性死亡情况。1.6碱性磷酸酶活性检测

取1×105个每毫升的细胞悬液3 mL加入小号培养瓶，将其置于体积分数5%的二氧化碳培养箱，37℃培养24 h，细胞贴壁后弃掉原有培养液，A～D组均加入质量分数100%的浸提液，E组加入新鲜原培养液，分别于第4天和第7天中止培养，收集80μL细胞悬液，以AKP试剂盒通过HTS 7000plus多孔板高效分析仪行AKP活性测试。

1.7成骨细胞与材料的复合培养

将载有nHA-PEA复合膜的血盖片试样置于6孔板内，环氧乙烷冷消毒，磷酸缓冲盐溶液浸泡清洗3次，每次1 h，DMEM孵育过夜备用。取1×105个每毫升的细胞悬液，分别接种于已准备好的材料上，37℃，体积分数5%的二氧化碳孵箱继续静置培养5 d。分别于第1天和第5天将试样取出，以体积分数10%的多聚甲醛固定，体积分数30%～100%的乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯置换乙醇，临界点干燥，表面喷金，SEM下观察。1.8统计学分析

使用单因素方差分析，分析各组总体均数间差别有无统计学意义，在检验数据之前对数据行方差齐性检验。用q检验比较两组间均数的差别。P>0.05为差异无统计学意义。

2结果

2.1细胞生长观察及甲噻唑四唑氮比色结果

显微镜下，不同质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液组及对照组细胞培养6 h后均已贴壁，12 h细胞突逐渐舒展，24 h细胞开始铺展，72 h后细胞数目明显增多，排列规则密集，细胞呈梭形、三角形或不规则形，形态分析各试验组与对照组细胞形态相似，显示各组细胞均生长良好。试验组和对照组不同时间的MTT比色结果见表1。试验组间的MTT值及其与其对照组间的差异无统计学意义（P>0.05）；试验组成骨细胞的相对增殖率为92%～107%，不同质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液组对成骨细胞的细胞毒性级数为0～

1级（0级：细胞相对增殖率大于等于100%，1级：细胞相对增殖率为90%～99%）[5]，不同质量分数浸提液组间差异无统计学意义（P>0.05）。

3讨论

在生物医学材料的细胞毒性试验方法中，最常用的是材料浸提液培养法和细胞材料直接接触法。本试验综合运用了这两种方法，首先选择浸渍法，具体原因如下。1）对于nHA-PEA复合材料，nHA的生物相容性勿庸置疑；而PEA是新型的人工合成的生物降解型高分子材料，其理化性能和降解性能已有相关研究[6]，但其生物相容性鲜有报道。2）由于直接接触法共同培养时，细胞对材料表面和对培养孔板底部的黏附性有差异，细胞洗脱率的不同会产生干扰而使试验复杂化。事实上，仅需考察nHA-PEA复合材料溶出物的

细胞毒性，就可以达到初步评价其生物相容性的目的，而且以材料的浸提液代替材料本身在材料学的研究中已得到公认。本试验严格按照国际标准化组织ISO 10993-5医疗器械生物学评价标准和要求制备生物医学材料浸提液[4]，以浸提出最大量的滤出物质，考察其对成骨细胞增殖和细胞周期的影响。

MTT比色是常用的细胞增殖能力检测方法，可以对材料的细胞毒性作出可靠的定量评价[5]。本试验在相差倒置显微镜下观察到nHA-PEA复合材料浸提液不影响细胞的生长形态；MTT值在试验组间以及各组与对照组间差异无统计学意义，试验组的细胞增殖率在92%～107%，表明nHA-PEA复合材料浸提液对成骨细胞的生长无不良影响。因此在进一步地对细胞周期和功能进行的分析中，仅选用最高质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液作为试验组进行分析比较。在加入HA的试验组，MTT值略高于对照组，但差异无统计学意义且无量效关系。原因可能与其中的钙、磷水平较高有关。

流式细胞计数已广泛应用于肿瘤学、生物化学和免疫学等领域，细胞周期检测已成为生物材料生物相容性评价的一种可靠方法和指标[7]，是常规细胞增殖试验的一项重要补充。近年来，生物材料生物相容性研究进展之一是生物材料的生物功能性评价[8]。生物材料作用于细胞后使其周期改变，从而使其行为和功能发生改变。本试验在MTT比色的基础上进一步使用流式细胞计数，旨在从细胞增殖周期的角度来分析nHA-PEA复合材料浸提液对细胞增殖周期DNA合成的影响，从分子水平上评价材料的细胞毒性。从MTT比色可见，组间、组内不同质量分数的nHA-PEA复合材料浸提液对成骨细胞的增殖和增殖周期影响不大，细胞周期各亚期组成比和程序性死亡率差异亦无统计学意义。B、C、D组处于S期的细胞略多，表明加入HA对细胞增殖有一定促进作用，但不显著，不存在量效关系。此结果与MTT比色结果一致。

除了对细胞增殖的影响，生物材料的细胞相容性还表现在材料对细胞重要功能的影响。AKP是骨形成所必需的酶，是生物矿化和成骨细胞分化成熟的早期标志物[9-10]：其表达代表骨形成状况，表明细胞分化的开始，并随细胞分化的发展而增强；其活性的高低，反映了相应细胞向成骨方向化的趋势。本研究采用酶联法对成骨细胞AKP的表达进行检测，结果显示试验组AKP的表达量与对照组相比较差异无统计学意义，说明nHA-PEA复合材料对成骨细胞的功能酶表达无不良影响，也没有明显的促进作用，不抑制其分化功能。

用浸提液作为试验样品测定复合材料中滤出物质对细胞生长、增殖的影响，仅为预测材料植入体内的潜在危害提供了初步依据，其结果尚有一定的局限性；因此，需在浸渍试验良性结果的基础上再采用直接法将成骨细胞与材料联合培养，以进一步考察材料本体的结构性能对细胞生物学的影响。本研究表明，成骨细胞在复合材料上具有良好的黏附、铺展和增殖行为，即nHA-PEA复合材料具有成骨细胞相容性和良好的细胞相容性等特性。

4参考文献

[1]Wei G, Ma PX. Structure and properties of nano-hydroxyapatite/polymer composite scaffolds for bone tissue engineering[J]. Biomaterials, 2004, 25（19）：4749-4757.

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[8]杨晓芳,奚廷斐.生物材料生物相容性评价研究进展[J].生物医学工程学杂志, 2001, 18（1）：123-128.

生物细胞作用篇6

[关键词] 静磁场；溶胶-凝胶生物活性玻璃；成骨细胞

[中图分类号] R782.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2013）15-0053-03

溶胶-凝胶生物活性玻璃是一种含有硅、钠、钙和磷等成分的透明生物活性材料[1]，医用开发的生物活性玻璃具有与天然骨类似的组成，生物相容性好，可与生物组织产生直接的化学结合，植入人体后可参加新陈代谢使骨组织生长，是一类可以与骨组织良好键合的骨修复材料[2]。已发现生物活性玻璃能够促进人成骨细胞增殖[3]。

磁力在20世纪70年代后期被引入正畸学领域以来，就备受关注[4]。研究表明， 0.062 T的静磁场可以促进成骨细胞的增殖[5]。由于以往多为单独研究生物活性玻璃或静磁场对成骨细胞的影响，本研究初次探讨静磁场结合溶胶-凝胶生物活性玻璃同时对成骨细胞的作用，观察成骨细胞在两者共同作用下的增殖性，推断其对牙槽骨改建的潜在影响[6]，为正畸临床医生矫治错畸形患者寻找更好的治疗方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 静磁场的设计 参考仇丽鸿等[7]的方法，将两块钕铁硼永磁体（15 cm×9 cm×2 cm）充磁后分别固定于特制的长方形盒子（15 cm×9 cm×2 cm）内。在长方形盒子的间位置可放置96孔细胞培养板，调节96孔细胞培养板及两块钕铁硼永磁体之间的位置关系， 应用特斯拉测定仪测定培养板底部的磁场强度， 使其磁场强度为 0.062 T。

1.1.2 生物活性玻璃 采用溶胶-凝胶法制备的生物活性玻璃58S，由华南理工大学材料学院提供。

1.1.3 实验细胞 Wistar大鼠成骨细胞株由上海拜力生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 溶胶-凝胶生物活性玻璃的配制 将粉末状的溶胶-凝胶生物活性玻璃 58 S高温高压灭菌后，按1 mg/mL浓度配入培养基，静置24 h后，用0.22 μm过滤膜过滤，最后将其浸提液按1：9稀释10倍待用。

1.2.2 分组方法 复苏Wistar大鼠成骨细胞株，并传代培养至第4代后随机分为四组： ①空白组：成骨细胞培养组；②溶胶-凝胶生物活性玻璃实验组：溶胶-凝胶生物活性玻璃溶剂内成骨细胞细胞生长组；③静磁场作用下成骨细胞实验组：0.062 T静磁场作用下成骨细胞生长组；④静磁场作用下溶胶-凝胶生物活性玻璃实验组：0.062 T静磁场作用下，溶胶-凝胶生物活性玻璃溶剂内成骨细胞生长组。

1.2.3 细胞增殖（MTT）的测定 用含 5%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔 104个细胞接种到 96 孔板，每孔体积 100 μL，每个样本做 3 个复孔。37℃、5 mL/L CO2培养箱中培养24 h、48 h、72 h、120 h。每孔加 MTT 溶液（5 mg/mL用 PBS 配制，pH=7.4）20 μL。继续孵育4 h，终止培养，小心吸取孔内培养上清液。每孔加 150 μL DMSO，振荡 10 min，使结晶物充分溶解。选择 490 nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

1.3 统计学方法

所有数据采用SPSS 13.0 统计软件处理。差异分析应用方差分析和t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

见表1。随着细胞培养时间的增加，各组细胞出现不同程度的增殖，通过任意两组组间比较t值在24 h、48 h、72 h、120 h时间点的比较，可知四组间成骨细胞在24 h、48 h、72 h、120 h各个时间点的增殖性存在显著性差异。本研究结果表明，与空白组相比，三个实验组的增值率在48 h之前均呈现递增趋势，48 h之后均呈现递减趋势，在48 h达到最高点；并且成骨细胞的增殖率在48 h时，58 S溶胶-凝胶生物活性玻璃与0.062 T静磁场共同作用组最高。

3 讨论

随着生物磁技术与人工材料的发展，有关磁场、人工材料作用与生物学效应的研究，取得了积极的成果，各类磁场强度治疗及生物活性玻璃在医学中的基础和临床应用研究越来越广泛。但是有关静磁场和生物活性玻璃对骨组织作用和相关代谢机制的研究较少[8]。课题组首次应用体外研究探讨静磁场加生物活性玻璃同时对成骨细胞增殖的影响，为今后进一步基础及临床研究打下基础。

本研究结果表明，与空白组相比较，0.062 T磁感应强度的静磁场、溶胶-凝胶法制备的生物活性玻璃58S、以及二者共同作用，在这三种因素作用下，成骨细胞增殖率均在48 h之前呈现递增趋势，48 h之后均呈现递减趋势，在48 h时达到最高点；58S溶胶-凝胶生物活性玻璃与0.062 T静磁场共同作用组的成骨细胞增殖率在任何时间点均高于其余三组。由本实验研究可得出，磁感应强度为0.062 T的静磁场与溶胶-凝胶法制备的生物活性玻璃58S相互协调、共同作用，对成骨细胞的增殖起到相互加强的作用。

成骨细胞不仅是骨形成的主要效应细胞，而且对破骨细胞的分化和成熟具有重要调控作用，因此在骨改建的过程中处于一个中心调控的地位。牙-牙槽骨独特的生物学特性是正畸牙得以移动的基础。0.062 T磁感应强度的静磁场与溶胶-凝胶法制备的生物活性玻璃58 S相互协调、共同作用时，更强地促进成骨细胞的增殖。而增殖是生物体最根本的生命活动，对于骨缺损、骨吸收等骨性疾病，促增殖作用显得尤为重要，由此静磁场加生物活性玻璃可更好地促进牙槽骨的改建，这为今后静磁场加生物活性玻璃在临床正畸治疗上的应用研究奠定基础。

[参考文献]

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[7] 仇丽鸿，包扬，钟鸣，等. 静磁场对大鼠成骨细胞增殖分化功能的影响[J]. 实用口腔医学杂志，2005，21（5）：606-609.

生物细胞作用篇7

【关键词】 5?氮?2?脱氧胞苷；xaf1基因；bgc823肿瘤细胞株；甲基化；细胞增殖；细胞凋亡

【abstract】 aim: to observe the effects of the demethylating agent, 5?aza?2′?deoxyctidine (5?aza?cdr), on the proliferation, cell cycle, apoptosis and xaf1 mrna expression of stomach cancer bgc823 cells. methods: the proliferation of bgc823 cells treated by different concentrations of 5?aza?cdr was detected by mtt assay. assessment of cell cycle and apoptosis were performed by flow cytometry (fcm); the change of xaf1 mrna expression was semi?quantified by rt?pcr before and after 5?aza?cdr treatment. results: the growth inhibitory effects on bgc823 cells were observed in a dose?dependent manner after exposure to 5?aza?cdr at different concentrations (1×103, 5×103, 10×103 nmol/l) for different time. fcm analysis showed that the apoptosis rates in bgc823 cells ［(4.53±0.21)%, (8.11±1.01)%, (11.56±0.86)%］ increased significantly after exposure to 5?aza?cdr for 72 h as compared with the control group ［(0.51±0.01)%, p<0.05］. no expression of xaf1 gene in bgc823 cells was observed, but it was expressed after 5?aza?cdr treatment (5×103, 10×103 nmol/l). conclusion: 5?aza?cdr can inhibit the proliferation of bgc823 cells through blocking cell cycles and inducing cell apoptosis. it can also restore xaf1 gene transcription silenced by demethylation.

【keywords】 5?aza?cdr；xaf1；bgc823；methylation；proliferation；apoptosis

0 引言

凋亡抑制蛋白因子家族(iap)的成员在结构上具有1至3个高度保守的杆状病毒凋亡抑制因子重复序列(bir)结构域［1］，在肿瘤的增殖异常及对抗肿瘤药物耐受形成中发挥了重要作用. x染色体相关凋亡抑制蛋白(xiap)是iap中抑制caspase活性最强的成员. xiap相关因子1(xaf1)是一个新近发现可以拮抗xiap抗凋亡作用的蛋白，它可以逆转xiap对细胞的保护. xaf1在多种肿瘤细胞和组织中存在低表达或表达缺失，xaf1的基因沉默与其启动子高甲基化明显相关［2］. 我们采用5?aza?cdr对胃癌细胞株进行处理, 检测xaf1基因表达，并分析肿瘤细胞生物学行为变化，以期进一步探讨胃癌的发生机制及 治疗 的新方法.

1 材料和方法

1.1 材料 胃癌bgc823细胞株（兰州大学病理解剖学教研室）；rpmi?1640培养液（美国gibco公司）；胎牛血清（兰州民海生物技术有限公司）；5?aza?cdr（美国sigma公司）；配制5?aza?cdr为1 mol/l的母液，-20℃保存，使用时用rpmi?1640稀释为工作浓度. tap酶（上海生工生物工程技术有限公司）；酶联免疫检测仪(bio?tek公司)；trizol(invitrogen公司)；uv3000紫外分光光度仪（上海美谱达公司）；流式细胞仪(beckman coulter公司).

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞贴壁生长于rpmi?1640培养液中，内含100 ml/l胎牛血清、1×105/l青霉素、100 mg／l链霉素和2 mmol/l l?谷氨酰胺，置于37℃ 50 ml/l co2的饱和湿度箱中培养，每3～4 d消化传代1次. 传代时，常规消化bgc823细胞，置于75 mm培养瓶中，培养24 h后分别用含1×103，5×103，10×103 nmol/l 5?aza?cdr的完全培养液连续培养24，48和72 h后弃去药液，用完全培养液继续培养24 h后进行实验. 以同体积磷酸盐缓冲液pbs(ph 7.4)处理的细胞作为对照组. 培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态的变化.

1.2.2 mtt法绘制细胞生长曲线 取对数生长期细胞，常规消化后按每孔2×103个(100 μl)接种于6块96孔培养板中，过夜贴壁后弃完全培养液，分别加入含1×103，5×103，10×103 nmol/l 5?aza?cdr药液的完全培养液，每孔100 μl，每组设3个复孔；对照组加入等量pbs. 每日取出1板加入5 g/l mtt液10 μl，37℃孵育4 h后加dmso 150 μl，振荡器振荡10 min充分溶解结晶，在酶联免疫检测仪测定各孔a470 nm值，求其平均值，以a470 nm值为纵坐标，时间(d)为横坐标绘制生长曲线, 计算 细胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate，cpir). cpir(％)=(1-实验组a470 nm均值／对照组a470 nm均值)×100％.

1.2.3 rt?pcr检测xaf1基因mrna表达 取对数生长期bgc823细胞，药物处理方法同1.2.1. 收集细胞，trizol一步反向法抽提细胞总rna，在紫外分光光度仪上测定吸光度值，鉴定rna纯度，a260 nm／a280 nm在1.8～2.0之间. pcr引物设计及反应条件如下：xaf1：预期产物片段大小为120 bp，退火温度：56℃；sense：5′?tgggtgtaggattctccagg?3′，antisense：5′?ggtttgcccaaggactacaa?3′. 内参照gapdh:预期产物片段大小为456 bp，退火温度：52℃；sense：5′?ttctccccattccgtcttcc?3′，antisense：5′?gtacatggtattcaccaccc?3′，上述引物由大连宝生物有限公司提供合成. 两步法rt?pcr：① 逆转录反应：20 μl反应体系含：2 μg模板rna，0.5 g/l oligo(dt)18，rnase?free ddh2o，5×reaction buffer，2×107 u/l rnase inhibitor，10 mmol/l dntp mix，2×107 u/l a?mulv rt. 70℃ 5 min，37℃ 5 min，37℃ 60 min，70℃ 10 min，4℃保存. ② 聚合酶链反应：50 μl反应体系含：cdna 1 μl，10×buffer 5 μl，25 mmol/l mgcl2 3 μl，2.5 mmol/l dntp 5μl，tap酶0.5 μl，上下游引物各1 μl，去离子水补至50 μl，gapdh作内参照. pcr仪扩增条件：94℃变性4 min，按94℃ 30 s，52℃（或54℃）40 s，72℃ 45 s，进行35个循环，最后一个循环72℃延伸5 min. pcr产物经20 g/l琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统分析，以xaf1和gapdh吸光度比值相对定量.

1.2.4 细胞周期和凋亡率检测 取对数生长期bgc823细胞，药物处理方法同1.2.1. 收集培养细胞，pbs洗2次，调整细胞密度为1×109个／l，700 ml/l冷乙醇－20℃固定24 h，加rnasea至终浓度1 g/l，37℃温育30 min，加碘化丙啶至终浓度50 g／l，1 h内测定. 以流式细胞仪进行细胞周期分析和凋亡率的检测.

统计学处理:实验数据以x±s表示，采用spss 11.5软件进行分析，不同组间率的比较采用单因素方差分析.

2 结果

2.1 5?aza?cdr对细胞增殖的 影响 分别用1×103，5×103，10×103 nmol/l 5?aza?cdr处理6 d后，bgc823细胞的生长增殖活性均有明显抑制，3个试验组的cpir值分别为（22.36±0.68）%，（32.12±1.27）%和（41.34±1.62）%，与对照组相比差异显著（p<0.05），并且随浓度的增加其抑制的量效关系显著(图1).

bp<0.01 vs对照（n=3, x±s）.

图1 bgc823细胞经5?aza?cdr处理前后的生长曲线（略）

2.2 5?aza?cdr对细胞中xaf1基因mrna表达的影响 5?aza?cdr处理前bgc823细胞系的xaf1基因mrna不表达，在经5×103，10×103 nmol/l 5?aza?cdr处理后，xaf1基因mrna重新表达，10×103 nmol/l的5?aza?cdr处理组尤为明显，在用药48，72 h后，该基因表达呈明显上升的趋势(图2，3).

2.3 5?aza?cdr对细胞周期的影响 bgc823细胞经1×103，5×103，10×103 nmol/l 5?aza?cdr处理72 h后，s期的细胞数量逐渐增加，g2/m期细胞数下降，凋亡率明显增加 (表1).

m：50 bp dna ladder maker d512a；1：对照组；2～4：5×103 nmol/l 5?aza?cdr分别作用24，48和72 h；5～7：10×103 nmol/l 5?aza?cdr分别作用24，48和72 h.

图2 bgc823细胞经5?aza?cdr处理前后gapdh mrna的表达（略）

m：50 bp dna ladder maker d512a；1：对照组；2～4：5×103 nmol/l 5?aza?cdr分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.22，0.32，0.37)；5～7：10×103 nmol/l 5?aza?cdr分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.90，0.98，1.31).

图3 bgc823细胞经5?aza?cdr处理前后xaf1 mrna的表达（略）

表1 bgc823细胞经5?aza?cdr处理72 h后细胞周期的变化（略）

ap＜0.05, bp＜0.01 vs对照.

3 讨论

dna甲基化是由s?腺苷甲硫氨酸(sam)作为甲基供体，在细胞内甲基转移酶(dna methyltransferase，dnmt)的催化作用下，在胞嘧啶(c)的第五位碳原子上加上甲基基团，变成5?甲基胞嘧啶(5?mc)的化学修饰过程［3］. 近期 研究 表明，多种人类肿瘤在 发展 过程中表现异常dna甲基化模式，常见为甲基化酶水平提高、整个基因组范围甲基化减弱以及局部甲基化水平增高3种，以局部甲基化水平增强较多见［4］. xaf1基因定位于染色体17p13.2位点，研究表明，xaf1基因在多种肿瘤细胞株以及肝癌［5］、结肠癌［6］、黑色素细胞瘤［7］组织中表达降低，存在转录抑制现象，现已证明xaf1基因表达沉默与5′区域cpg岛异常高甲基化相关，转录过程中调控区域的cpg岛高甲基化导致xaf1基因表遗传修饰而失活. 我们采用不同浓度(5×103，10×103 nmol/l)的特异性dnmt抑制剂5?aza?cdr，对体外培养的胃癌bgc823细胞进行干预，rt?pcr结果显示在5?aza?cdr作用前，xaf1 mrna不表达，而在5?aza?cdr作用后，xaf1 mrna又重新表达，表达强度呈时间和剂量依赖关系，表明dna甲基化与基因遗传学改变不同，基因的缺失、突变等遗传学改变是不可逆的，而甲基化的dna核苷酸序列未发生改变，仅通过个别碱基的修饰来影响基因转录，因而是可逆的［8］. 因此我们通过5?aza?cdr人为的干预拮抗表遗传学改变，诱导因表遗传学改变而失活的xaf1基因表达，为去甲基化 治疗 肿瘤提供了 理论 基础.

凋亡在细胞增殖、肿瘤形成和发展中也起调控作用［9］. 我们 应用 不同浓度(1×103，5×103，10×103 nmol/l)5?aza?cdr诱导胃癌bgc823细胞后，mtt结果显示：细胞增殖受到明显抑制；流式细胞仪细胞周期 分析 可见s期的细胞数逐渐增加，g2/m期细胞数下降，同时细胞凋亡率明显增加呈时间和浓度依赖关系. 这一结果显示去甲基化后能使细胞阻滞于s期，而使得进入g2/m期的细胞减少，由此推断5?aza?cdr的去甲基化作用可通过影响细胞周期而抑制胃癌细胞的增殖；同时xaf1基因去甲基化后重新表达，它可直接结合并抑制xiap对caspase活性的抑制作用从而发挥诱导凋亡作用［2］，xaf1也是一种新的干扰素(ifn)诱导基因，其介导了ifn诱导凋亡的作用，并显著增强了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(trail)诱导肿瘤细胞凋亡的作用［10］.

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生物细胞作用篇8

【关键词】  5氮2脱氧胞苷；xaf1基因；bgc823肿瘤细胞株；甲基化；细胞增殖；细胞凋亡

【abstract】  aim:  to observe the effects of the demethylating agent, 5aza2′deoxyctidine (5azacdr), on the proliferation, cell cycle, apoptosis and xaf1 mrna expression of stomach cancer bgc823 cells.  methods:  the proliferation of bgc823 cells treated by different concentrations of 5azacdr was detected by mtt assay.  assessment of cell cycle and apoptosis were performed by flow cytometry (fcm); the change of xaf1 mrna expression was semiquantified by rtpcr before and after 5azacdr treatment.  results:  the growth inhibitory effects on bgc823 cells were observed in a dosedependent manner after exposure to 5azacdr at different concentrations (1×103, 5×103, 10×103 nmol/l) for different time.  fcm analysis showed that the apoptosis rates in bgc823 cells ［(4.53±0.21)%, (8.11±1.01)%, (11.56±0.86)%］ increased significantly after exposure to 5azacdr for 72 h as compared with the control group ［(0.51±0.01)%, p<0.05］.  no expression of xaf1 gene in bgc823 cells was observed, but it was expressed after 5azacdr treatment (5×103, 10×103 nmol/l). conclusion:  5azacdr can inhibit the proliferation of bgc823 cells through blocking cell cycles and inducing cell apoptosis.  it can also restore xaf1 gene transcription silenced by demethylation.

【keywords】 5azacdr；xaf1；bgc823；methylation；proliferation；apoptosis

0  引言

   

凋亡抑制蛋白因子家族(iap)的成员在结构上具有1至3个高度保守的杆状病毒凋亡抑制因子重复序列(bir)结构域［1］，在肿瘤的增殖异常及对抗肿瘤药物耐受形成中发挥了重要作用. x染色体相关凋亡抑制蛋白(xiap)是iap中抑制caspase活性最强的成员. xiap相关因子1(xaf1)是一个新近发现可以拮抗xiap抗凋亡作用的蛋白，它可以逆转xiap对细胞的保护. xaf1在多种肿瘤细胞和组织中存在低表达或表达缺失，xaf1的基因沉默与其启动子高甲基化明显相关［2］. 我们采用5azacdr对胃癌细胞株进行处理, 检测xaf1基因表达，并分析肿瘤细胞生物学行为变化，以期进一步探讨胃癌的发生机制及 治疗 的新方法.

1  材料和方法

1.1  材料  胃癌bgc823细胞株（兰州大学病理解剖学教研室）；rpmi1640培养液（美国gibco公司）；胎牛血清（兰州民海生物技术有限公司）；5azacdr（美国sigma公司）；配制5azacdr为1 mol/l的母液，-20℃保存，使用时用rpmi1640稀释为工作浓度. tap酶（上海生工生物工程技术有限公司）；酶联免疫检测仪(biotek公司)；trizol(invitrogen公司)；uv3000紫外分光光度仪（上海美谱达公司）；流式细胞仪(beckman coulter公司).

1.2  方法

1.2.1  细胞培养  细胞贴壁生长于rpmi1640培养液中，内含100 ml/l胎牛血清、1×105/l青霉素、100 mg／l链霉素和2 mmol/l l谷氨酰胺，置于37℃ 50 ml/l co2的饱和湿度箱中培养，每3～4 d消化传代1次. 传代时，常规消化bgc823细胞，置于75 mm培养瓶中，培养24 h后分别用含1×103，5×103，10×103 nmol/l 5azacdr的完全培养液连续培养24，48和72 h后弃去药液，用完全培养液继续培养24 h后进行实验. 以同体积磷酸盐缓冲液pbs(ph 7.4)处理的细胞作为对照组. 培养过程中使用相差显微镜观察细胞形态的变化.

1.2.2  mtt法绘制细胞生长曲线  取对数生长期细胞，常规消化后按每孔2×103个(100  μl)接种于6块96孔培养板中，过夜贴壁后弃完全培养液，分别加入含1×103，5×103，10×103 nmol/l 5azacdr药液的完全培养液，每孔100 μl，每组设3个复孔；对照组加入等量pbs. 每日取出1板加入5 g/l mtt液10 μl，37℃孵育4 h后加dmso 150 μl，振荡器振荡10 min充分溶解结晶，在酶联免疫检测仪测定各孔a470 nm值，求其平均值，以a470 nm值为纵坐标，时间(d)为横坐标绘制生长曲线, 计算 细胞增殖抑制率(cellular proliferation inhibition rate，cpir). cpir(％)=(1-实验组a470 nm均值／对照组a470 nm均值)×100％.

1.2.3  rtpcr检测xaf1基因mrna表达  取对数生长期bgc823细胞，药物处理方法同1.2.1. 收集细胞，trizol一步反向法抽提细胞总rna，在紫外分光光度仪上测定吸光度值，鉴定rna纯度，a260 nm／a280 nm在1.8～2.0之间. pcr引物设计及反应条件如下：xaf1：预期产物片段大小为120 bp，退火温度：56℃；sense：5′tgggtgtaggattctccagg3′，antisense：5′ggtttgcccaaggactacaa3′. 内参照gapdh:预期产物片段大小为456 bp，退火温度：52℃；sense：5′ttctccccattccgtcttcc3′，antisense：5′gtacatggtattcaccaccc3′，上述引物由大连宝生物有限公司提供合成. 两步法rtpcr：① 逆转录反应：20 μl反应体系含：2 μg模板rna，0.5 g/l oligo(dt)18，rnasefree ddh2o，5×reaction buffer，2×107 u/l  rnase inhibitor，10 mmol/l dntp mix，2×107 u/l amulv rt.  70℃ 5 min，37℃ 5 min，37℃ 60 min，70℃ 10 min，4℃保存. ② 聚合酶链反应：50 μl反应体系含：cdna 1 μl，10×buffer 5 μl，25 mmol/l mgcl2 3 μl，2.5 mmol/l dntp 5μl，tap酶0.5 μl，上下游引物各1 μl，去离子水补至50 μl，gapdh作内参照. pcr仪扩增条件：94℃变性4 min，按94℃ 30 s，52℃（或54℃）40 s，72℃ 45 s，进行35个循环，最后一个循环72℃延伸5 min. pcr产物经20 g/l琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统分析，以xaf1和gapdh吸光度比值相对定量.

1.2.4  细胞周期和凋亡率检测  取对数生长期bgc823细胞，药物处理方法同1.2.1. 收集培养细胞，pbs洗2次，调整细胞密度为1×109个／l，700 ml/l冷乙醇－20℃固定24 h，加rnasea至终浓度1 g/l，37℃温育30 min，加碘化丙啶至终浓度50 g／l，1 h内测定. 以流式细胞仪进行细胞周期分析和凋亡率的检测.

   

统计学处理:实验数据以x±s表示，采用spss 11.5软件进行分析，不同组间率的比较采用单因素方差分析.

2  结果

2.1  5azacdr对细胞增殖的 影响   分别用1×103，5×103，10×103 nmol/l 5azacdr处理6 d后，bgc823细胞的生长增殖活性均有明显抑制，3个试验组的cpir值分别为（22.36±0.68）%，（32.12±1.27）%和（41.34±1.62）%，与对照组相比差异显著（p<0.05），并且随浓度的增加其抑制的量效关系显著(图1).

bp<0.01 vs对照（n=3, x±s）.

图1  bgc823细胞经5azacdr处理前后的生长曲线（略）

2.2  5azacdr对细胞中xaf1基因mrna表达的影响  5azacdr处理前bgc823细胞系的xaf1基因mrna不表达，在经5×103，10×103 nmol/l 5azacdr处理后，xaf1基因mrna重新表达，10×103 nmol/l的5azacdr处理组尤为明显，在用药48，72 h后，该基因表达呈明显上升的趋势(图2，3).

2.3  5azacdr对细胞周期的影响  bgc823细胞经1×103，5×103，10×103 nmol/l 5azacdr处理72 h后，s期的细胞数量逐渐增加，g2/m期细胞数下降，凋亡率明显增加 (表1).

m：50 bp dna ladder maker d512a；1：对照组；2～4：5×103 nmol/l 5azacdr分别作用24，48和72 h；5～7：10×103 nmol/l 5azacdr分别作用24，48和72 h.

图2  bgc823细胞经5azacdr处理前后gapdh mrna的表达（略）

m：50 bp dna ladder maker d512a；1：对照组；2～4：5×103 nmol/l 5azacdr分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.22，0.32，0.37)；5～7：10×103 nmol/l 5azacdr分别作用24，48和72 h(相对定量值分别为0.90，0.98，1.31).

图3  bgc823细胞经5azacdr处理前后xaf1 mrna的表达（略）

表1  bgc823细胞经5azacdr处理72 h后细胞周期的变化（略）

ap＜0.05, bp＜0.01 vs对照.

3  讨论

   

dna甲基化是由s腺苷甲硫氨酸(sam)作为甲基供体，在细胞内甲基转移酶(dna methyltransferase，dnmt)的催化作用下，在胞嘧啶(c)的第五位碳原子上加上甲基基团，变成5甲基胞嘧啶(5mc)的化学修饰过程［3］. 近期 研究 表明，多种人类肿瘤在 发展 过程中表现异常dna甲基化模式，常见为甲基化酶水平提高、整个基因组范围甲基化减弱以及局部甲基化水平增高3种，以局部甲基化水平增强较多见［4］. xaf1基因定位于染色体17p13.2位点，研究表明，xaf1基因在多种肿瘤细胞株以及肝癌［5］、结肠癌［6］、黑色素细胞瘤［7］组织中表达降低，存在转录抑制现象，现已证明xaf1基因表达沉默与5′区域cpg岛异常高甲基化相关，转录过程中调控区域的cpg岛高甲基化导致xaf1基因表遗传修饰而失活. 我们采用不同浓度(5×103，10×103 nmol/l)的特异性dnmt抑制剂5azacdr，对体外培养的胃癌bgc823细胞进行干预，rtpcr结果显示在5azacdr作用前，xaf1 mrna不表达，而在5azacdr作用后，xaf1 mrna又重新表达，表达强度呈时间和剂量依赖关系，表明dna甲基化与基因遗传学改变不同，基因的缺失、突变等遗传学改变是不可逆的，而甲基化的dna核苷酸序列未发生改变，仅通过个别碱基的修饰来影响基因转录，因而是可逆的［8］. 因此我们通过5azacdr人为的干预拮抗表遗传学改变，诱导因表遗传学改变而失活的xaf1基因表达，为去甲基化 治疗 肿瘤提供了 理论 基础.

   

凋亡在细胞增殖、肿瘤形成和发展中也起调控作用［9］. 我们 应用 不同浓度(1×103，5×103，10×103 nmol/l)5azacdr诱导胃癌bgc823细胞后，mtt结果显示：细胞增殖受到明显抑制；流式细胞仪细胞周期 分析 可见s期的细胞数逐渐增加，g2/m期细胞数下降，同时细胞凋亡率明显增加呈时间和浓度依赖关系. 这一结果显示去甲基化后能使细胞阻滞于s期，而使得进入g2/m期的细胞减少，由此推断5azacdr的去甲基化作用可通过影响细胞周期而抑制胃癌细胞的增殖；同时xaf1基因去甲基化后重新表达，它可直接结合并抑制xiap对caspase活性的抑制作用从而发挥诱导凋亡作用［2］，xaf1也是一种新的干扰素(ifn)诱导基因，其介导了ifn诱导凋亡的作用，并显著增强了肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(trail)诱导肿瘤细胞凋亡的作用［10］.

【 参考 文献 】

 

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［2］ byun ds, cho k, ryu bk, et al. hypermethylation of xiapassociated factor 1, a putative tumor suppressor gene from the 17p13.2 locus, in human gastric adenocarcinomas［j］.cancer res, 2003， 63(4):7068-7075.

［3］ jones p a, takai d. the role of dna methylation in mammalian epigenetics［j］. science, 2001, 293(5532):1068-1070.

［4］ momparler rl, bovenzi v. dna methylation and cancer［j］. cell physiol, 2000, 183(2):145-154.

［5］ sakemi r, yano h, ogasawara s, et al. xlinked inhibitor of apoptosis (xiap) and xiapassociated factor1 expressions and their relationship to apoptosis in human hepatocellular carcinoma and noncancerous liver tissues［j］. j oncol rep, 2007, 18(1):65-70.

［6］ chung sk, lee ng, rvu bk, et al. frequent alteration of xaf1 in human colorectal cancers: implication for tumor cell resistance to apoptotic stresses［j］.gasteoenterology, 2007，132(7):2459-2477.

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［8］ murakami j, asaumi j, maki y, et al. effects of demethyhting agent 5aza2deoxycytidine and histone deacetylase inhibitor fr901228 on maspin gene expression in oral cancer cell lines［j］. oral oncel, 2004, 40:597-603.