摘要：【目的】构建用于制备级分离及高效鉴定黑麦籽粒Waxy蛋白亚基的技术体系，为该亚基理化特性的分析、功能的发掘及Waxy种质的快速筛选等提供理论参考。【方法】设计特异引物从灌浆期间的奥地利黑麦籽粒cDNA中克隆获得Waxy，并进行体外表达；利用DuoFlow对籽粒蛋白提取物进行纯化，对峰值收集物、原核表达产物及其Ni柱纯化的重组Waxy蛋白进行SDS-PAGE分离，挖取蛋白条带进行MALDI-TOF质谱鉴定，结合经由基因序列所推导的氨基酸序列，确定回收产物的Waxy蛋白属性；在优化电泳条件的基础上构建针对Waxy蛋白的毛细管电泳体系；同时，利用部分黑麦品种对DuoFlow及CE体系的有效性进行验证。【结果】核苷酸序列分析表明，从奥地利黑麦cDNA中克隆获得一条覆盖Waxy全长的编码序列（GenBank登录号：KF559182），其理论编码产物约为60kD；利用DuoFlowQ1阳离子交换柱，以低浓度Tris-Hcl（20mmol-L^-1Tris—Hcl，pH9．5）进行蛋白挂柱，高浓度NaCl（20mmol·L^-1Tris＋1mol·L^-1NaCl，pH9．5）进行蛋白洗脱，214nm波长检测，实现了对籽粒Waxy蛋白的DuoFlOW高效分离；纯化产物的SDS—PAGE条带大小、质谱鉴定肽段与黑麦、小麦Waxy蛋白序列相似性的统计结果表明，DuoFlOW峰值回收产物具有黑麦Waxy亚基一致的特征序列，故属于Waxy蛋白；以DuoFlow纯化产物为标准样，以0．05mm01·L^-1硼砂＋15％乙腈＋1％SDS溶液（pH9．5）为缓冲液，采用分离电压20kV，温度25℃，检测波长214nm，压力进样，0．5psi×5S，在11-12min处获得峰值约12mAU单一主峰，图形清晰，基线水平，从而构建了Waxy蛋白的CE鉴定体系，且籽粒Waxy蛋白提取物能直接用于对该亚基的检测；同时，利用黑麦品种对上述体系的验证结果表明，DuoFlow及CE体系适于对Waxy亚基的高效分离与通量检测。【结论】从奥地利栽培黑麦cDNA文库中克隆获得

关键词：奥地利栽培黑麦 waxy蛋白 毛细管电泳 duoflow蛋白纯化系统 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱 

单位：西北农林科技大学农学院 陕西杨凌712100 陕西省小麦工程技术研究中心/陕西省小麦新品种培育工程研究中心 陕西杨凌712100