摘要：【目的】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得编辑BMPR-IB（bone morphogenetic protein receptor,type IB）基因的猪胎儿成纤维细胞（pig fetal fibroblasts,PFF）,并研究该基因被编辑后对骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins,BMPs）信号通路中重要功能基因表达的影响。【方法】针对猪的BMPR-IB基因的外显子8,利用在线软件http：//crispr.mit.edu获得了21条sg RNAs（single-guide RNAs）序列;得分最高的sg RNA与互补序列（包含接头）退火成双链后连接入线性化的lenti CRISPR v2质粒以获得打靶质粒,打靶质粒与包装质粒ps PAX2和p CMV-VSV-G按5﹕4﹕1质量比混合后通过293T细胞包装慢病毒。慢病毒溶液经0.45μm滤膜回收后与PFF细胞培养液按照1﹕1混合、并加入聚凝胺（polybrene）至终浓度为6μg·m L-1,在1 000 g转速、32℃下离心感染PFF细胞1 h。感染3 d后,细胞在含3.5μg·m L-1嘌呤霉素的培养液中筛选6—7 d,最终获得编辑BMPR-IB基因的PFF细胞克隆群。针对编辑（打靶）细胞,首先通过T7E1酶切检测突变体,初步判断打靶效率,再通过PCR、PCR-TA克隆分析细胞的编辑及脱靶情况。利用RT-PCR检测编辑和对照组细胞中与BMPs信号通路相关的重要基因的表达情况;Western blotting检测编辑细胞与对照组细胞中BMPR-IB基因的蛋白表达量。利用Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂盒检测编辑细胞及对照组细胞的增殖能力。【结果】T7E1酶切及PCR测序均证实PFF细胞成功打靶目标DNA区域;TA克隆测序表明目标区域发生了插入与缺失突变,突变率为70%。针对20个潜在的脱靶位点的TA克隆测序结果表明,仅1个位点出现了10%（2/20）的脱靶情况。RT-PCR结果显示,打靶细胞与对照组细胞相比,BMPR-IB、Cylin D2、Cdk2和Bcl2基因的表达量均极显著下降（P0.05）;打靶PFF的增殖能力不受嘌呤霉素筛选的影响。【结论】慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术可针对PFF细�

关键词：慢病毒 猪胎儿成纤维细胞 脱靶 细胞增殖 

单位：江西农业大学猪遗传改良与养殖技术省部共建国家重点实验室; 南昌330045