摘要：【目的】大豆(Glycinemax(L.)Merr.)种子从发育成熟期(R6或R7期)开始具有活力,在此时期容易受到高温高湿胁迫,导致种子活力下降。通过对GmLEA的研究,揭示其高温高湿胁迫下的表达水平以及功能,为一步深入研究GmLEA在参与大豆种子活力形成及响应非生物胁迫等方面奠定基础。【方法】利用Primer Premier5.0软件设计引物,以宁镇1号和湘豆3号叶片的cDNA为模板,分离大豆GmLEA的cDNA序列全长。通过NCBI网站BLAST对GmLEA同源性氨基酸序列进行搜索,使用MEGA6.0和DNAMAN多重比对蛋白质序列,并采用MEGA6.0的N-J算法构建进化树。通过酵母双杂交试验验证GmLEA与GmCDPKSK5在酵母体内的互作。构建亚细胞定位和双分子荧光互补(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)载体,通过基因枪介导法转化烟草叶片分析GmLEA与GmCDPKSK5在烟草叶片细胞内的互作及其编码蛋白的亚细胞定位。利用实时荧光定量PCR技术(qRT-PCR)对GmLEA的组织特异性表达及其在高温高湿胁迫下的表达进行分析。构建pBI121融合表达载体,通过农杆菌介导法获得3个纯合的T3代过表达拟南芥株系,对高温高湿胁迫下拟南芥的种子活力进行分析。【结果】获得大豆GmLEA的cDNA序列全长,该基因包含一个长1377bp的开放阅读框(ORF);且该基因所编码的蛋白定位在烟草叶片细胞的细胞膜上。酵母双杂交试验与双分子荧光互补(BiFC)试验结果表明,GmLEA与GmCDPKSK5分别在酵母体内与烟草叶片细胞的细胞膜上存在特异性互作。组织特异性分析结果表明,GmLEA主要在宁镇1号和湘豆3号2个品种发育和成熟的种子中表达。在湘豆3号种子发育过程中GmLEA的表达量呈先上升后下降的趋势,在开花后50d达最大值,在宁镇1号种子发育过程中该基因的表达量呈上升的趋势,在开花后60d达到最大值。高温高湿胁迫后,与对照相比,GmLEA在湘豆3号中96h时下调表达,其余时间点均上调�

关键词：大豆 gmlea gmcdpksk5 高温高湿 种子活力 

单位：南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室; 南京210095