摘要：[目的]茶树咖啡碱合成酶1(TCS1)是山茶属(Camellia)茶组植物咖啡碱合成的关键酶,TCS1具有丰富的等位变异。从我国丰富的茶树种质资源中发掘TCS1稀有等位变异并研究其功能,深入解析茶树咖啡碱合成机制,为低咖啡碱育种提供新的基因资源。[方法]利用特异引物TCS1PInDelF/R对673份茶树资源中的TCS1等位变异进行鉴定;使用引物TCS1cDNAF/R,从含有新稀有等位变异的茶树资源中克隆基因的cDNA全长序列;利用生物信息学、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和原核表达等方法研究新发现稀有等位基因的功能。[结果]在部分大理茶(C.taliensis)资源中鉴定到一个新的TCS1稀有等位变异,命名为TCS1g。从大理茶资源‘龙陵17’(LL17,含有的TCS1等位变异为TCS1a和TCS1g)中克隆了TCS1g。TCS1g的编码区序列全长为1098bp,编码365个氨基酸,编码蛋白的分子量和理论等电点分别为40.9kD和5.1。序列比对结果表明,TCS1g与TCS1a、TCS1b、TCS1c、TCS1d、TCS1e、TCS1f的相似度在94.1%99.2%;与具有可可碱合成酶活性(TS)的TCS1b和TCS1c编码蛋白序列相似度均大于96.7%,而与同时具有TS和咖啡碱合成酶(CS)活性的TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f相似度都小于95.4%,且TCS1g第221位氨基酸残基与TCS1b、TCS1c同为组氨酸(His),而TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f为精氨酸(Arg)。第221位氨基酸残基位于TCS1g蛋白活性中心,该位点的突变(His突变为Arg),可以导致TCS1g的等电点(5.05变为5.06)和亲水性(-0.119变为-0.123)发生改变。此外,5′上游调控区域的比对结果显示TCS1g、TCS1b、TCS1c起始密码子(ATG)比TCS1a、TCS1d、TCS1e、TCS1f延后了15bp。原核表达发现TCS1g具有TS活性,活性为44.3pkat/mg,但未检测到CS活性。qRT-PCR的结果表明LL17中等位变异TCS1g有表达。LL17的咖啡碱和可可碱的含量分别为40.3mg·g^-1和5.4mg·g^-1。[结论]鉴定并克隆了一个新的TCS1稀有等位变异TCS1g,其在LL17中具有一定的表达水平,且其�

关键词：等位变异 咖啡碱合成酶 功能分析 嘌呤生物碱 茶树 

单位：中国农业科学院茶叶研究所/农业农村部茶树生物学与资源利用重点实验室; 杭州310008; 中国农业科学院研究生院; 北京100081