【关键词】 角膜缘干细胞；回顾性研究；进展
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1004-4949（2013）06-35-02
干细胞研究被誉为新世纪生物和医学技术领域可能取得革命性突破的项目，20世纪80年代角膜缘干细胞理论确立，在角膜缘干细胞研究中产生了一些新概念，角膜缘干细胞广泛应用于眼表疾病的治疗，角膜缘干细胞研究成为眼科界近年来发展较快的领域之一。本文对近年来在角膜缘干细胞研究方面的新进展进行综述。
1 角膜缘干细胞治疗眼表疾病的机制
角膜缘干细胞是位于角膜缘基底上皮层的特殊细胞。角膜缘干细胞的高增殖潜力在角膜上皮的修复中具有重要作用，角膜缘干细胞为角膜上皮更新和修复之来源，角膜上皮有由周边向中心移动的特性。角膜上皮的更新是通过一种从角膜缘向角膜中央的向心性运动来完成的，上皮再生的源头位于角膜缘，角膜上皮的更新和创伤修复来源于角膜缘基底层的干细胞增生和分化。角膜缘有丰富的Ⅳ型胶原纤维，该纤维仅存在于结膜和角膜缘基底膜，是构成干细胞增生分化局部微环境的重要组成部分。
2 角膜缘干细胞移植
2.1 自体角膜缘干细胞移植： 随着人们对角膜缘及其干细胞研究的进展，实验表明在促进眼表面愈合、减少角膜新生血管长入和假性胬肉形成方面，角膜缘移植明显优于球结膜移植，这进一步证明角膜缘移植的有效性。该手术多是将自体健眼角膜缘部组织片移植到患眼角膜缘部受损区，自体角膜缘上皮移植不仅能为病变区角膜缘提供健康的上皮来源，使角膜恢复正常透明性，而且可为病变区结膜和巩膜组织提供正常的角膜缘干细胞，有效的阻止异常结膜源性组织增生，达到重建正常组织和牢固的角膜上皮层之目的，减少并发症，提高视功能，自体移植不存在免疫排斥，成功率高[1]。
2.2 同种异体角膜缘干细胞移植： 自体角膜缘干细胞移植只对单侧眼表疾病者适用，而对那些双眼眼疾者不适用，角膜缘丰富的血管和淋巴细胞，使角膜缘不再是免疫赦免区，成人角膜HLA-DR抗原主要分布于角膜下及其基质深层，且HLA-DR抗原在角膜移植排斥反应中起主要作用，角膜缘为免疫排斥的高危区域。Tan等[2]在异体角膜缘移植术前术后使用了免疫抑制剂同种异体角膜缘移植获得成功。近年来不断有新的免疫抑制药物出现，免疫排斥仍是异体角膜缘移植面临的最大难题。
2.3 培养角膜缘干细胞移植
2.3.1 自体角膜缘干细胞培养后移植。
近年来，随着角膜缘干细胞培养技术的成熟，将角膜缘干细胞体外培养后异体移植成为另一研究热点。Lindberg等[3]体外培养角膜缘干细胞，并成功地移植到裸鼠皮下，并牢固地粘附在植床上；Pellaegrini等[4]用自体健眼1mm×1mm×1mm角膜缘干细胞组织块经体外培养扩增后，借助软性角膜接触镜的辅助，移植到患眼上，成功地实现了眼表重建。自体角膜缘干细胞培养后移植不仅解决了自体干细胞来源不足的问题，而且避免了同种异体间移植后的排斥反应。被认为是目前最有前途的治疗方法。除此之外，有专家用人羊膜为支架，成功进行了人自体培养的角膜缘干细胞移植，治疗干细胞缺乏的眼表疾病；还有专家行角膜缘干细胞羊膜片移植治疗角膜缘功能障碍。这些研究证实，培养自体角膜缘干细胞移植提供了一种极好的技术来重建眼表，没有排异反应，供体眼角膜缘少量取材，不损伤干细胞群及角膜，细胞体外培养和扩增技术提供供体细胞来源。
2.3.2 异体角膜缘干细胞培养后移植。
潘志强等[5]以人羊膜为载体，分别将原代培养的人角膜缘干细胞接种在羊膜上面，然后把含有干细胞的羊膜片分别移植到化学烧伤或热烧伤后有角膜新生血管形成的人眼角膜上，角膜干细胞羊膜移植术后，移植片在受体植床上能够存在并与巩膜和结膜完全融合为一体，羊膜逐渐被受体组织吸收，角膜透明度增加，基质炎性浸润减轻，上皮光滑，角膜新生血管减少，视力不同程度的提高，这说明移植的角膜干细胞在受体角膜中存活并进行正常增殖和分化形成角膜上皮细胞。临床观察中未发现明显的排斥反应，异体角膜缘干细胞培养后移植目前已取得了一定的效果，它给临床上双眼角膜缘干细胞不同程度功能障碍病人带来曙光。至于植后是否会出现排斥反应等一系列问题都有待于进一步的研究。
4 角膜缘干细胞移植进展与发展趋势
角膜缘干细胞移植已成为目前眼科研究一大热点，随着多学科交叉、现代生物技术的发展，角膜缘干细胞的定位、分离、培养问题已经得到解决，人工角膜的研究已经取得了实质性进展。在国外已有多型人工角膜应用于临床，在治疗难治性角膜病变方面显示出越来越多的优越性。虽然还有相当多的问题亟待解决。一旦培养的角膜干细胞移植术成功，就不仅解决了角膜缘移植材料供应不足的问题，而且用自体组织来源的角膜缘干细胞进行移植可以消除移植排斥反应的发生。可以预见在不久的将来，离体培养的角膜缘干细胞将为那些角膜缘功能衰竭患者带来希望，并且为临床眼用药物筛选提供细胞模型，具有广阔的应用前景。
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健康网讯:
吕广秀 201314上海市第85医院儿科 1998年11月，美国James和John Gearhart领导的2个科学小组分别阐述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞（ES cells）和胚胎生殖细胞系（EG cells） ［1，2］ 。ES细胞最引人关注的2条特征是:ES细胞能在体外条件下生长，在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性，即发育成成体中各种细胞的能力。
ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究，如果克隆技术可以从患者自体组织中获得干细胞，则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基因运载系统。总之，其前景十分广泛。
1 胚胎干细胞的一般定义特征
考虑到ES或EG细胞的特性，可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的，其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细胞所特有，或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能性干细胞所应具有的特征如下:（1）来源于一个全能性的细胞群体;（2）具有正常的细胞核型;（3）具永生性，在胚胎状态下能无限制的分裂;（4）培养的细胞株在体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonic tissues）和分属所有3种胚层的体细胞。但到目前为止，所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因，来源于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此，如果来源于人的细胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义，我们就认为它属于ES细胞。需要指出的是，要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是十分困难的，因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中，一些组织都是十分罕见的。
2 胚胎干细胞的最新研究
James Thomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能抑制ES细胞培养的滋养外胚层去除，内层细胞团移植到小鼠胚胎来源的成纤维细胞饲细胞层上，经过短暂的粘附和展开的过程，将细胞重新分散（disaggregated）并转移到另外的饲细胞层，在培养基和培养系统与方面，培养人ES细胞与小鼠ES细胞并没有太大的不同，而且人ES细胞的成功率相对还要高一些。Thomson等人培养猴ES细胞的工作无疑对他们首先成功培养人ES细胞是有很大帮助的。灵长类的全能性干细胞在很多方面与小鼠ES细胞是不同的，特别是在外形上，且灵长类全能性干细胞不容易分散成单个的细胞。因此，要正确辨认出所需的ES细胞并在传代过程中做到正确处理是十分重要的。但还有一个重要的条件，即人胚胎培养过程的改进，其包括不同发育阶段使用不同的培养基的两步培养系统，这使得能高效地得到高质量的人囊胚 ［4］ 。
Shamblott和同事 ［2］ 在《美国科学院论文集》上，报道从受精5～9周的胚胎和胎儿性腺中分离出全能性细胞。尽管人们对人体中原始生殖细胞的成熟过程的小细节知之甚少，但科学家们确实知道这个过程包括生殖母细胞迁移至性腺并开始扩增，随后性腺出现明显的性别分化。在这个阶段的胚胎和胎儿性腺中已经可以发现有表达生殖母细胞标志性分子的细胞 ［5］ 。Shamblott小组所使用的培养系统利用了已知能支持小鼠生殖母细胞在体外存活和有丝分裂的一些因子，即STO成纤维细胞饲细胞层、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子（LIF）和forskolin ［6］ 。由以上2种方法培养出的细胞在多大程度上能符合ES或EG细胞的一般标准?2种培养物都来源于全能性的细胞群，都能在体外培养过程中保持有正常的细胞核型。Thomson小组培养出的细胞株已经传代许多次，且细胞含有端粒酶活性，这2点都提示这个细胞株是永生的。Shamblott的EG细胞虽没有培养那么久，但也没有迹象显示这些细胞将会死亡。从囊胚中分离出的细胞能形成包含所有3个胚层组织的畸胎瘤，且个别组织表现为高级的组织结构性（例如可以形成神经管）。但是在体外情况下，细胞分化的证据只能限定于能表达一些滋养层和内皮层形成的某些标志性分子（如人绒毛膜促性腺激素和α-甲胎蛋白）;从生殖细胞来源的细胞株中没有能在体内形成畸胎瘤的证据，但是作者确实观察到了在胚状体（embryoid bodies）中存在细胞进行分化的情况。胚状体是一种在不适宜干细胞生长的条件下，由全能性干细胞在三维方向上生长所形成的一种结构。小鼠中胚状体包括两层，一层是胚胎外的内皮层，一层是外胚层。两种细胞之间的联接可能使外胚层细胞分化成多种细胞类型，这种现象类似于体内情况下胚胎培植早期的状况 ［2］ 。Shamblott将培养出来的胚状体切片，用免疫化学方法研究，发现不同细胞类型表达分别代表中胚层、内胚层和外胚层的单个标志分子。
人的干细胞的表型，即外形、抗原表达及培养条件等方面与其他种类的全能型细胞如小鼠的ES细胞或EC细胞相比有自己的特点。人EC细胞，猴和人的ES细胞在表型上十分相似，与小鼠细胞或人EG细胞极易区分开来。灵长类动物细胞在单层培养条件下呈扁平的克隆，细胞边界较清显;而小鼠ES细胞成堆生长，细胞更圆，细胞边界不清。灵长类动物全能型干细胞表达一系列特异性的表面抗原。小鼠ES细胞的自我更新可以被白血病抑制因子（LIF）或相关的细胞因子促进 ［7］ 但对人的ES细胞却没有这种作用 ［1，2］ 。
在Thomson和Shamblott这2个小组的成功带动下，目前对人ES细胞的研究出现一股热潮。如果成功，将给人类带来福音。倘若科学家最终能够成功诱导和调控体外培养的胚胎干细胞正常地分化，这将对基础研究和临床应用产生巨大的影响。有可能在以下领域发挥作用:体外研究人胚胎的正常发生发育，非正常发育（通过改变细胞系的靶基因），新的人类基因的发现，药物筛选和致畸实验，以及作为组织移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源等。
3 胚胎干细胞应用前景探讨
人胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的及早期时期的良好条件，这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题。采用基因 芯片等技术，比较人胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达，可以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制，发现新的人类基因。结合基因打靶技术，可发现不同基因在生命活动中的功能等。该应用有利于新药的发现及筛选，人胚胎干细胞使新药的药理、药效、毒理及药代等研究达到了细胞水平，极大减少了药物实验所需的动物数量。目前药物实验使用的细胞系基本上来自其他的种属，其结果常不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应。人胚胎干细胞还可用来研究人类疾病的发病机制和进展结果，从而可找到特效和永久的治疗方法。
人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官，因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神经变性疾病（帕金森综合征、
亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。尤其是对于后2项，胚胎干细胞可能会有特别疗效，至今认为成年人的心脏和胰岛几乎没有干细胞，自身无法得到修复。用于基因治疗和防止免疫排异反应，还可以对胚胎干细胞的基因做适当的修改。干细胞是基因治疗较理想的靶细胞，因为它可以自我复制更新，治疗基因通过它带入人体中，能够持久地发挥作用，而不象分化的细胞那样，在细胞更新中可能丢失治疗基因的结果。通过胚胎干细胞和基因治疗技术，可以矫正缺陷基因。例如，如果发现早期胚胎有某种基因缺陷而会患基因病如囊性纤维化—一种30岁以前便会致人死亡的疾病，可以收集部分或全部胚胎干细胞，通过基因工程技术将正常的基因替代干细胞中的缺陷基因，再将修复后的胚胎干细胞嵌入胚胎中，将会出生一个健康的婴儿。由于伦理和某些技术问题，现在还未开展此类实验。改变胚胎干细胞的某些基因的另一目的是创建“万能供者细胞”，即破坏细胞中表达组织相容性复合物的基因，躲避受者免疫系统的监视，从而达到防止免疫排异反应的发生。但这种方法需要破坏和改变细胞中许多基因，而且这种细胞发育成的组织和器官是否有生理缺陷?如免疫能力状况还不得而知。
另一种克服移植免疫排异的途径就是结合克隆技术创建患者特异性的胚胎干细胞。为避免患者自身对外源细胞的免疫排异反应，ES细胞的获得还有另一种方法，即从患者自身成熟细胞中取出细胞核，移植入去核的卵细胞中（即体细胞核转移技术SCˉNT），经过一系列的培养在体外分化成患者所需要的细胞或组织类型。这种包含与患者完全相同的遗传物质的杂合卵细胞在体外培养发育成囊胚，若将囊胚植入假孕妇女的子宫中，将会克隆出与提供体细胞的人基因相同的个体，即所谓的“克隆人”。但是如果从获得的囊胚中分离并扩增所谓的“人胚胎干细胞（ES）”，并体外诱导它们分化成胰岛细胞、神经元、心肌细胞等，将这些细胞移植至发病部位，则能够修复患者的组织或器官，从而使患者得到康复。用这种胚胎干细胞培养获得的细胞、组织或器官，其基因和细胞膜表面的主要组织相容性复合体与提供体细胞的患者完全一致，不会导致任何免疫排异反应。如果能成为现实，这将是人类医学史上一项划时代的成就，它将使器官培养专业化，全面解决供体器官来源不足的问题;并达到器官供应专一化，提供给患者相应性器官。人体中的任何器官和组织一旦出现异常，则医生可给予更换和修复。
利用核转移克隆技术以获取ES细胞，人卵子来源不足是目前的主要难题。至今为止，非人类哺乳动物的克隆效率非常低，大约100个以上的卵细胞才能得到1个有活力的克隆 ［8，9］ 。要解决这个问题，一是尽快找出卵细胞中使体细胞去分化的因子;二是寻找其他来源的卵细胞如尸体或废弃的胎儿，但这需要发展卵细胞在体外成熟的技术。曾经有人提出将人细胞核转入去核的牛卵子以获取胚胎干细胞，这项技术基于一种假设，即牛细胞质中的蛋白很快被人类的蛋白所取代，从而不会形成杂种细胞。
4 面对的挑战
要使上述设想变为现实，还需要对人胚胎干细胞做深入研究，还需要解决许多技术上的因素，这些问题包括:（1）人胚胎干细胞极易分化成其他细胞。如何维持体外扩增时不细胞异化?虽然在防止体外培养时干细胞分化方面已取得了很大成绩，如在培养基中加入白血病抑制因子等可抑制干细胞分化，但仍需进一步研究干细胞的培养条件。（2）如何定向诱导干细胞分化 ［10］ ?细胞分化是多种细胞因子互相作用引起细胞一系列复杂的生理生化变化的过程。要诱导产生某种特异类型的组织，就需要了解各种因子在何时何地开始作用，以及何时何地停止作用。但是科学家相信只要将胚胎干细胞诱导分化为所需组织细胞的前提（祖细胞），将祖细胞移植到适当的环境中就能够产生所需的组织，因为机体能够分泌所有指导细胞正确分化的因子;并且不必在体外形成结构精确的多细胞组织后再移植，只需要将已诱导的分散的胚胎细胞或细胞悬液注射到发病部位就可发挥作用，这些移植的细胞与周围细胞及胞外基质相互作用便可有机地整合至受体组织中 ［11］ 。（3）要使胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂的器官，这一目标还需要技术上的突破。因为器官的形成是一个非常复杂的三维过程。很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。例如，肺中的肌组织、血管和结缔组织来源于中胚层，而上皮组织源自内胚层。每个细胞要获得营养和排泄代谢产物，分化的组织中需要产生血管，组织血管化目前还处于起步研究阶段。就目前的水平来说对来自自然机体的器官要离体培养并维持其正常的生理功能还无法做到。器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。一种可能的方法是将干细胞注射到重度免疫缺陷动物的脏器中，让移植的人干细胞逐步替代动物细胞，使其脏器人源化，成为可供人体的器官移植。（4）如何克服移植后的问题?前面提到的改变基因创建“万能供者细胞”的方法是否可行还不清楚。核移植后的卵细胞能否激活沉默基因，启动DNA的合成，会不会改变染色体的结构等等问题，还有待进一步研究。而且，胚胎干细胞有形成畸胎瘤的倾向，必须对胚胎干细胞及其衍生细胞的移植的安全性做一全面、客观、深入的评价，极需人们对此作更深入的研究。
5 其他替代胚胎干细胞应用的技术
由于目前胚胎干细胞的研究存在伦理与法律上的部分难点无法解决，因此人们正在积极寻找替代胚胎干细胞的细胞的来源和技术。例如，根据现阶段的研究可以认为只有很少的几个信号途径参与控制细胞更新和维持其全能性，那么在只有有限分化能力的成体干细胞中激活这些途径是否能使它们保持在全能性的状态?在一些早期胚胎的已分化细胞可以看到这种去分化的现象，例如，小鼠和大鼠卵黄囊的内皮层细胞可以在invivo由异体分化（transdifˉferentiate）状态转变成全能性细胞 ［12］ ，将小鼠和人的生殖母细胞用一些信号分子处理可以转变成可自我更新的全能性细胞 ［1～3］ 。但目前主要的研究仍集中在将成体干细胞（adult stem cells）替代胚胎干细胞的研究上。成体干细胞是指从成熟机体组织中分离出来的干细胞，能在体外长期培养，在一定条件下能产生与所来源组织类型相同的细胞。至今为止已在多种组织中发现并分离出干细胞，甚至在像脑、肝脏这些更新较慢的组织中同样存在干细胞。在大部分组织中，必须通过特定的分子标志才能将干细胞与周围无关的细胞区分开来。这些分子标志物也能为如何控制干细胞的表型提供重要的线索。例如，表皮干细胞表达高水平的β 1 -integrins，而β 1 -integrins介导的细胞与胞外基质的粘附可以抑制干细胞终末分化的发生 ［13～16］ 。据原先的推测，成体干细胞只能分化为与来源组织类型相同的细胞，即血液干细胞只能分化出各种血液细胞，而神经干细胞只能分化出神经细胞。但是最近的一系列研究发现说明:通过控制周围环境，成体干细胞也能够分化成多种不同类型的细胞，表现出一定的多能性 ［17～20］ 。
Bjornson等人报道，将从小鼠前脑中的神经干细胞移植到用放射线照射处理后的小鼠的循环系统中，可以产生出包括骨髓细胞和淋巴细胞在内的多种血液细胞，这个结果说明神经干细胞具有比最初预想的更大的分化潜力 ［21］ 。Margaret A.Goodell领导的小组从小鼠骨骼肌中分离出一种干细胞，它能够分化成几乎所有种类的血液细胞，而且效力比完全的骨髓成分高10～14倍 ［22］ 。此外，陆续还有一些发现如大鼠肝脏中的干细胞可以在体内分化成心肌细胞 ［23］ ;小鼠血液干细胞分化成心肌细胞和血管内皮细胞 ［24］ ;人和小鼠神经干细胞分化成骨骼肌细胞 ［25］ ;人骨髓基质干细胞分化成多种非血液型细胞 ［26］ ;人体血液干细胞转化成肝脏细胞 ［27］ ;人神经干细胞可以转化成血液细胞和骨骼肌细胞 ［28］ 。目前笔者尚不明白在这个发生过程中的机制。笔者注意到在血液系统中的两个例子:在进行促分化处理前在单个的干细胞或前提细胞中能同时检测出多种细胞类型特有的相关基因的表达 ［29～30］ ，以及当B淋巴细胞细胞的正常分化由于Pax5的缺失被阻断后，B细胞前体细胞可以分化成多种其他类型的血液细胞 ［31］ 。这说明干细胞在分化成某个特定细胞类型之前存在一个相对混乱的状态，在这个状态下细胞中多种细胞类型相关的基因都会被激活。
以 上的发现要应用于临床还存在操作上的困难，必须寻找一种更容易得到，更容易控制分化的成体干细胞。目前比较理想的有人间质干细胞，这种细胞可以从成人骨髓中分离得到，能在去分化的状态下稳定复制，并能分化成多种间质组织包括骨、软骨、脂肪、腱、肌肉和骨髓基质等 ［32～33］ 。最近，从脂肪组织中分离出干细胞，它能分化成脂肪、软骨、肌 肉和骨组织 ［34］ ;另外从啮齿动物真皮中得到的干细胞可以产生出神经元、神经胶质、平滑肌细胞和脂肪细胞，可能可以作为未来理想的干细胞来源 ［35］ 。但到目前为止，成体干细胞能转化的细胞类型还十分有限，因此只能作为胚胎干细胞研究的一个备用方案。总之，胚胎干细胞的研究及应用，将使笔者们更加深入了解人类自身形成的过程，给人类带来全新的医疗方法。随着研究的深入，许多目前还无法治愈的疾病有可能借助胚胎干细胞及其相关技术而被治愈。
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1998年11月，美国James和JohnGearhart领导的2个科学小组分别阐 述如何利用囊胚和原始的胚胎生殖细胞培养出可能的人全能型胚胎干细胞（ESce lls）和胚胎生殖细胞系（EGcells）［1，2］。ES细胞最引人关注的2条特征 是:ES细胞能在体外条件下生长，在原始的去分化条件下能够无限地分裂;同时在体 外培养的所有时间内都能保持胚胎来源细胞的一个关键性特征—全能性，即发育成 成体中各种细胞的能力。
ES细胞的应用前景十分令人鼓舞。胚胎干细胞可以作为研究人类胚胎发育、出 生缺陷及胚胎瘤等疾病的新的手段;可以用于至今为止尚未进行的关于的方法;制造 人类疾病模型以利用于基础研究、药物开发和毒理学研究，如果克隆技术可以从患 者自体组织中获得干细胞，则它们可解决用于治疗退行性疾病的组织短缺以及结束 在移植治疗中使用免疫抑制剂;另外干细胞还可以用来作为基因治疗的一种新的基 因运载系统。总之，其前景十分广泛。
1胚胎干细胞的一般定义特征
考虑到ES或EG细胞的特性，可以认为有一些表型是所有的ES细胞都应该具有的 ，其他一些特点可能是属于从不同种属或不同组织中分离出来的某种特定全能性细 胞所特有，或表现出在胚胎发育过程中某个特定阶段所具有的特征。一般认为全能 性干细胞所应具有的特征如下:（1）来源于一个全能性的细胞群体;（2）具有正常 的细胞核型;（3）具永生性，在胚胎状态下能无限制的分裂;（4）培养的细胞株在 体外或在畸胎瘤中能自发分化成胚胎外组织（extraembryonictissues）和分属所 有3种胚层的体细胞。但到目前为止，所有已培养成功的哺乳动物细胞中，除小鼠 外，灵长类动物ES细胞只满足上述4条标准的前3条。一些研究人员将ES细胞的定义 限定为那些能分化成包括生殖细胞在内的所有的细胞。但出于伦理上的原因，来源 于人的ES细胞不可能进行试验以验证是否满足这一标准。因此，如果来源于人的细 胞能满足其他3条关于ES细胞的一般定义，我们就认为它属于ES细胞。需要指出的 是，要从体外培养或畸胎瘤试验验证一个ES细胞能否分化成所有组织类型的细胞是 十分困难的，因为不论在体外培养条件下或畸胎瘤中，一些组织都是十分罕见的。
2胚胎干细胞的最新研究
JamesThomson和同事于1998年报道利用治疗不孕症所遗弃的囊胚分离出ES细 胞。他们所使用的技术与分离小鼠ES细胞相似:将可能抑制ES细胞培养的滋养外胚 层去除，内层细胞团移植到小鼠胚胎来源的成纤维细胞饲细胞层上，经过短暂的粘 附和展开的过程，将细胞重新分散（disaggregated）并转移到另外的饲细胞层， 在培养基和培养系统与方面，培养人ES细胞与小鼠ES细胞并没有太大的不同，而且 人ES细胞的成功率相对还要高一些。Thomson等人培养猴ES细胞的工作无疑对他们 首先成功培养人ES细胞是有很大帮助的。灵长类的全能性干细胞在很多方面与小鼠 ES细胞是不同的，特别是在外形上，且灵长类全能性干细胞不容易分散成单个的细 胞。因此，要正确辨认出所需的ES细胞并在传代过程中做到正确处理是十分重要的 。但还有一个重要的条件，即人胚胎培养过程的改进，其包括不同发育阶段使用不 同的培养基的两步培养系统，这使得能高效地得到高质量的人囊胚［4］。
Shamblott和同事［2］在《美国科学院论文集》上，报道从受精 5～9周的胚胎和胎儿性腺中分离出全能性细胞。尽管人们对人体中原始生殖细胞的 成熟过程的小细节知之甚少，但科学家们确实知道这个过程包括生殖母细胞迁移至 性腺并开始扩增，随后性腺出现明显的性别分化。在这个阶段的胚胎和胎儿性腺中 已经可以发现有表达生殖母细胞标志性分子的细胞［5］。Shamblott小组所使 用的培养系统利用了已知能支持小鼠生殖母细胞在体外存活和有丝分裂的一些因子 ，即STO成纤维细胞饲细胞层、成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子（LIF）和f orskolin［6］。由以上2种方法培养出的细胞在多大程度上能符合ES或EG细胞 的一般标准?2种培养物都来源于全能性的细胞群，都能在体外培养过程中保持有正 常的细胞核型。Thomson小组培养出的细胞株已经传代许多次，且细胞含有端粒酶 活性，这2点都提示这个细胞株是永生的。Shamblott的EG细胞虽没有培养那么久， 但也没有迹象显示这些细胞将会死亡。从囊胚中分离出的细胞能形成包含所有3个 胚层组织的畸胎瘤，且个别组织表现为高级的组织结构性（例如可以形成神经管） 。但是在体外情况下，细胞分化的证据只能限定于能表达一些滋养层和内皮层形成 的某些标志性分子（如人绒毛膜促性腺激素和α-甲胎蛋白）;从生殖细胞来源的细 胞株中没有能在体内形成畸胎瘤的证据，但是作者确实观察到了在胚状体（embry oidbodies）中存在细胞进行分化的情况。胚状体是一种在不适宜干细胞生长的条 件下，由全能性干细胞在三维方向上生长所形成的一种结构。小鼠中胚状体包括两 层，一层是胚胎外的内皮层，一层是外胚层。两种细胞之间的联接可能使外胚层细 胞分化成多种细胞类型，这种现象类似于体内情况下胚胎培植早期的状况［2］ 。Shamblott将培养出来的胚状体切片，用免疫化学方法研究，发现不同细胞类型 表达分别代表中胚层、内胚层和外胚层的单个标志分子。
人的干细胞的表型，即外形、抗原表达及培养条件等方面与其他种类的全能型 细胞如小鼠的ES细胞或EC细胞相比有自己的特点。人EC细胞，猴和人的ES细胞在表 型上十分相似，与小鼠细胞或人EG细胞极易区分开来。灵长类动物细胞在单层培养 条件下呈扁平的克隆，细胞边界较清显;而小鼠ES细胞成堆生长，细胞更圆，细胞 边界不清。灵长类动物全能型干细胞表达一系列特异性的表面抗原。小鼠ES细胞的 自我更新可以被白血病抑制因子（LIF）或相关的细胞因子促进［7］但对人的 ES细胞却没有这种作用［1，2］。
在Thomson和Shamblott这2个小组的成功带动下，目前对人ES细胞的研究出现 一股热潮。如果成功，将给人类带来福音。倘若科学家最终能够成功诱导和调控体 外培养的胚胎干细胞正常地分化，这将对基础研究和临床应用产生巨大的影响。有 可能在以下领域发挥作用:体外研究人胚胎的正常发生发育，非正常发育（通过改 变细胞系的靶基因），新的人类基因的发现，药物筛选和致畸实验，以及作为组织 移植、细胞治疗和基因治疗的细胞源等。
3胚胎干细胞应用前景探讨
人胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究人体发育过程中的及早期时期的 良好条件，这种研究不会引起与胚胎实验相关的伦理问题。采用基因芯片等技术 ，比较人胚胎干细胞以及不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基因转录和表达，可 以确定胚胎发育及细胞分化的分子机制，发现新的人类基因。结合基因打靶技术， 可发现不同基因在生命活动中的功能等。该应用有利于新药的发现及筛选，人胚胎 干细胞使新药的药理、药效、毒理及药代等研究达到了细胞水平，极大减少了药物 实验所需的动物数量。目前药物实验使用的细胞系基本上来自其他的种属，其结果 常不能真正代表正常的人体细胞对药物的反应。人胚胎干细胞还可用来研究人类疾 病的发病机制和进展结果，从而可找到特效和永久的治疗方法。
人胚胎干细胞最有价值的应用是用来修复甚至替换已丧失功能的组织和器官， 因为它具有发育分化成所有类型组织细胞的能力。任何导致丧失正常细胞的疾病都 可以通过移植由胚胎干细胞分化而来的特异组织细胞来治疗，如用神经细胞治疗神 经变性疾病（帕金森综合征、亨廷顿舞蹈症、阿尔茨海默病等），用造血干细胞重 建造血功能，用胰岛细胞治疗糖尿病，用心肌细胞修复已坏死的心肌等。尤其是对 于后2项，胚胎干细胞可能会有特别疗效，至今认为成年人的心脏和胰岛几乎没有 干细胞，自身无法得到修复。用于基因治疗和防止免疫排异反应，还可以对胚胎干 细胞的基因做适当的修改。干细胞是基因治疗较理想的靶细胞，因为它可以自我复 制更新，治疗基因通过它带入人体中，能够持久地发挥作用，而不象分化的细胞那 样，在细胞更新中可能丢失治疗基因的结果。通过胚胎干细胞和基因治疗技术，可 以矫正缺陷基因。例如，如果发现早期胚胎有某种基因缺陷而会患基因病如囊性纤 维化—一种30岁以前便会致人死亡的疾病，可以收集部分或全部胚胎干细胞，通过 基因工程技术将正常的基因替代干细胞中的缺陷基因，再将修复后的胚胎干细胞嵌 入胚胎中，将会出生一个健康的婴儿。由于伦理和某些技术问题，现在还未开展此 类实验。改变胚胎干细胞的某些基因的另一目的是创建“万能供者细胞”，即破坏 细胞中表达组织相容性复合物的基因，躲避受者免疫系统的监视，从而达到防止免 疫排异反应的发生。但这种方法需要破坏和改变细胞中许多基因，而且这种细胞发 育成的组织和器官是否有生理缺陷?如免疫能力状况还不得而知。
另一种克服移植免疫排异的途径就是结合克隆技术创建患者特异性的胚胎干细 胞。为避免患者自身对外源细胞的免疫排异反应，ES细胞的获得还有另一种方法， 即从患者自身成熟细胞中取出细胞核，移植入去核的卵细胞中（即体细胞核转移技 术SCˉNT），经过一系列的培养在体外分化成患者所需要的细胞或组织类型。这种 包含与患者完全相同的遗传物质的杂合卵细胞在体外培养发育成囊胚，若将囊胚植 入假孕妇女的子宫中，将会克隆出与提供体细胞的人基因相同的个体，即所谓的“ 克隆人”。但是如果从获得的囊胚中分离并扩增所谓的“人胚胎干细胞（ES）”， 并体外诱导它们分化成胰岛细胞、神经元、心肌细胞等，将这些细胞移植至发病部 位，则能够修复患者的组织或器官，从而使患者得到康复。用这种胚胎干细胞培养 获得的细胞、组织或器官，其基因和细胞膜表面的主要组织相容性复合体与提供体 细胞的患者完全一致，不会导致任何免疫排异反应。如果能成为现实，这将是人类 医学史上一项划时代的成就，它将使器官培养专业化，全面解决供体器官来源不足 的问题;并达到器官供应专一化，提供给患者相应性器官。人体中的任何器官和组 织一旦出现异常，则医生可给予更换和修复。
利用核转移克隆技术以获取ES细胞，人卵子来源不足是目前的主要难题。至今 为止，非人类哺乳动物的克隆效率非常低，大约100个以上的卵细胞才能得到1个有 活力的克隆［8，9］。要解决这个问题，一是尽快找出卵细胞中使体细胞去分 化的因子;二是寻找其他来源的卵细胞如尸体或废弃的胎儿，但这需要发展卵细胞 在体外成熟的技术。曾经有人提出将人细胞核转入去核的牛卵子以获取胚胎干细胞 ，这项技术基于一种假设，即牛细胞质中的蛋白很快被人类的蛋白所取代，从而不 会形成杂种细胞。
4面对的挑战
要使上述设想变为现实，还需要对人胚胎干细胞做深入研究，还需要解决许多 技术上的因素，这些问题包括:（1）人胚胎干细胞极易分化成其他细胞。如何维持 体外扩增时不细胞异化?虽然在防止体外培养时干细胞分化方面已取得了很大成绩 ，如在培养基中加入白血病抑制因子等可抑制干细胞分化，但仍需进一步研究干细 胞的培养条件。（2）如何定向诱导干细胞分化［10］?细胞分化是多种细胞因 子互相作用引起细胞一系列复杂的生理生化变化的过程。要诱导产生某种特异类型 的组织，就需要了解各种因子在何时何地开始作用，以及何时何地停止作用。但是 科学家相信只要将胚胎干细胞诱导分化为所需组织细胞的前提（祖细胞），将祖细 胞移植到适当的环境中就能够产生所需的组织，因为机体能够分泌所有指导细胞正 确分化的因子;并且不必在体外形成结构精确的多细胞组织后再移植，只需要将已 诱导的分散的胚胎细胞或细胞悬液注射到发病部位就可发挥作用，这些移植的细胞 与周围细胞及胞外基质相互作用便可有机地整合至受体组织中［11］。（3）要 使胚胎干细胞在体外发育成一完整的器官尤其是像心、肝、肾、肺等大型精细复杂 的器官，这一目标还需要技术上的突破。因为器官的形成是一个非常复杂的三维过 程。很多器官是两个不同胚层的组织相互作用而形成的。例如，肺中的肌组织、血 管和结缔组织来源于中胚层，而上皮组织源自内胚层。每个细胞要获得营养和排泄 代谢产物，分化的组织中需要产生血管，组织血管化目前还处于起步研究阶段。就 目前的水平来说对来自自然机体的器官要离体培养并维持其正常的生理功能还无法 做到。器官的体外保存和维持仍是器官移植中的难题。一种可能的方法是将干细胞 注射到重度免疫缺陷动物的脏器中，让移植的人干细胞逐步替代动物细胞，使其脏 器人源化，成为可供人体的器官移植。（4）如何克服移植后的问题?前面提到的改 变基因创建“万能供者细胞”的方法是否可行还不清楚。核移植后的卵细胞能否激 活沉默基因，启动DNA的合成，会不会改变染色体的结构等等问题，还有待进一步 研究。而且，胚胎干细胞有形成畸胎瘤的倾向，必须对胚胎干细胞及其衍生细胞的 移植的安全性做一全面、客观、深入的评价，极需人们对此作更深入的研究。
5其他替代胚胎干细胞应用的技术
由于目前胚胎干细胞的研究存在伦理与法律上的部分难点无法解决，因此人们
正在积极寻找替代胚胎干细胞的细胞的来源和技术。例如，根据现阶段的研究可以
认为只有很少的几个信号途径参与控制细胞更新和维持其全能性，那么在只有有限
分化能力的成体干细胞中激活这些途径是否能使它们保持在全能性的状态?在一些
早期胚胎的已分化细胞可以看到这种去分化的现象，例如，小鼠和大鼠卵黄囊的内
皮层细胞可以在invivo由异体分化（transdifˉferentiate）状态转变成全能性细
胞［12］，将小鼠和人的生殖母细胞用一些信号分子处理可以转变成可自我更
新的全能性细胞［1～3］。但目前主要的研究仍集中在将成体干细胞（adult
stemcells）替代胚胎干细胞的研究上。成体干细胞是指从成熟机体组织中分离出
来的干细胞，能在体外长期培养，在一定条件下能产生与所来源组织类型相同的细
胞。至今为止已在多种组织中发现并分离出干细胞，甚至在像脑、肝脏这些更新较
慢的组织中同样存在干细胞。在大部分组织中，必须通过特定的分子标志才能将干
细胞与周围无关的细胞区分开来。这些分子标志物也能为如何控制干细胞的表型提
供重要的线索。例如，表皮干细胞表达高水平的β1-integrins，而β1-inte
grins介导的细胞与胞外基质的粘附可以抑制干细胞终末分化的发生［13～16］
。据原先的推测，成体干细胞只能分化为与来源组织类型相同的细胞，即血液干
细胞只能分化出各种血液细胞，而神经干细胞只能分化出神经细胞。但是最近的一
系列研究发现说明:通过控制周围环境，成体干细胞也能够分化成多种不同类型的
细胞，表现出一定的多能性［17～20］。
Bjornson等人报道，将从小鼠前脑中的神经干细胞移植到用放射线照射处理后
的小鼠的循环系统中，可以产生出包括骨髓细胞和淋巴细胞在内的多种血液细胞，
这个结果说明神经干细胞具有比最初预想的更大的分化潜力［21］。Margaret
A.Goodell领导的小组从小鼠骨骼肌中分离出一种干细胞，它能够分化成几乎所有
种类的血液细胞，而且效力比完全的骨髓成分高10～14倍［22］。此外，陆续
还有一些发现如大鼠肝脏中的干细胞可以在体内分化成心肌细胞［23］;小鼠血
液干细胞分化成心肌细胞和血管内皮细胞［24］;人和小鼠神经干细胞分化成骨
骼肌细胞［25］;人骨髓基质干细胞分化成多种非血液型细胞［26］;人体血
液干细胞转化成肝脏细胞［27］;人神经干细胞可以转化成血液细胞和骨骼肌细
胞［28］。目前笔者尚不明白在这个发生过程中的机制。笔者注意到在血液系
统中的两个例子:在进行促分化处理前在单个的干细胞或前提细胞中能同时检测出
多种细胞类型特有的相关基因的表达［29～30］，以及当B淋巴细胞细胞的正常
分化由于Pax5的缺失被阻断后，B细胞前体细胞可以分化成多种其他类型的血液细
胞［31］。这说明干细胞在分化成某个特定细胞类型之前存在一个相对混乱的
状态，在这个状态下细胞中多种细胞类型相关的基因都会被激活。
以上的发现要应用于临床还存在操作上的困难，必须寻找一种更容易得到，更
容易控制分化的成体干细胞。目前比较理想的有人间质干细胞，这种细胞可以从成
人骨髓中分离得到，能在去分化的状态下稳定复制，并能分化成多种间质组织包括
骨、软骨、脂肪、腱、肌肉和骨髓基质等［32～33］。最近，从脂肪组织中分
离出干细胞，它能分化成脂肪、软骨、肌肉和骨组织［34］;另外从啮齿动物
真皮中得到的干细胞可以产生出神经元、神经胶质、平滑肌细胞和脂肪细胞，可能
可以作为未来理想的干细胞来源［35］。但到目前为止，成体干细胞能转化的
细胞类型还十分有限，因此只能作为胚胎干细胞研究的一个备用方案。总之，胚胎
干细胞的研究及应用，将使笔者们更加深入了解人类自身形成的过程，给人类带来
全新的医疗方法。随着研究的深入，许多目前还无法治愈的疾病有可能借助胚胎干
细胞及其相关技术而被治愈。
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据英国媒体报道，英国研究人员首次用3D打印机打印出胚胎干细胞，干细胞鲜活且保有发展为其他类型细胞的能力。我们知道，胚胎干细胞存在于胚胎发育早期的囊胚中，可发育为不同的细胞，是所有细胞最初期的形态。胚胎干细胞是万能的，意味着它们可以发育成为身体内200多种细胞类型中的任何一种。研究人员说，这种技术或可制造人体组织以测试药物，制造器官，乃至直接在人体内打印细胞。
胚胎干细胞3D打印机配备两个“生物墨盒”，一个装着浸在细胞培养基中的人体胚胎干细胞，另一个只有培养基。计算机控制微调阀喷出“墨水”，其速度可通过改变喷口直径实现精确控制。
打印机上有显微镜，可以观察细胞打印情况。两种“墨水”一层一层间隔喷洒，形成不同浓度细胞飞沫，最小飞沫体积仅2纳升，包含大约5个细胞。飞沫被喷入有诸多凹孔的培养皿中，翻转培养皿，飞沫形成悬液，在各凹孔内“抱成团”。打印机可精确控制飞沫大小，使干细胞达到分化的最佳状态。
研究人员在《生物制造》杂志说，检测结果显示，打印24小时后，95%以上细胞仍然存活，打印过程未杀死细胞；打印3天后，超过89%细胞存活，而且仍然维持多能性，即分化出多种细胞组织的潜能。
研究人员已经用3D打印的干细胞制造出骨髓和皮肤。他们认为，最终能借助这种方法制造器官，从而无需器官捐献，同时还可以解决器官移植中的免疫抑制等问题。
A. “诱导干细胞”与普通皮肤细胞相比，功能有差异，形态、结构也有差异
B. 神经干细胞和神经元中的DNA、mRNA和蛋白质都完全相同
C. 抑制“TRIM32”的表达有助于建立神经干细胞的细胞系
D. 激活成年人沉睡的神经干细胞并促进“TRIM32”的表达，可形成更多新的神经元
2. 利用下列细胞工程技术培养出的新个体中，只具有一个亲本遗传性状的是（ ）
①细胞和组织培养 ②细胞融合 ③动物胚胎移植 ④克隆羊技术（多利）
A. ①② B. ②③ C. ① D. ①④
3. 污染是植物组织培养过程中的最大技术难题，可发生于不同的对象和不同阶段，某同学按照教材中的实验操作，结果发现在培养基中出现白色晕圈或有色菌落，下列关于此项分析错误的是（ ）
A. 可能是锥形瓶口处理不当
B. 组织培养的每一个环节都有可能出现污染
C. 可在培养基中添加生长素等物质来避免污染
D. 先初培养，挑出无污染的物质再进行培养，可减少污染
4. 通过发酵到大规模生产谷氨酸，生产中常用的菌种是溶氧的氨酸棒状杆菌。下面在有关谷氨酸发酵过程的叙述，正确的是（ ）
A. 溶氧充足时，发酵液中有乳酸的累积
B. 发酵液中碳源和氮源比例的变化不影响谷氨酸的产量
C. 菌体中谷氨酸的排出，有利于谷氨酸的合成和产量的提高
D. 发酵液pH呈碱性时，有利于谷氨酸棒状杆菌生成乙酰谷氨酰胺
5. 海带中富含胡萝卜素，海带多糖和碘等营养物质。胡萝卜素有助于防癌抗癌，碘是合成甲状腺激素的原料，海带多糖能抑制免疫细胞的凋亡。有关叙述中不正确的是（ ）
A. 合理的饮食和健康的生活方式能预防癌症
B. 寒冷时血液中甲状腺激素含量上升
C. 海带多糖诱发免疫细胞基因突变，从而抑制免疫细胞凋亡
D. 对放疗的癌症患者，可给予海带多糖辅助治疗
6. 下列关于细胞生理活动的叙述，正确的是（ ）
A. 细胞分化使各种细胞的遗传物质有所差异，导致细胞的形态和功能各不相同
B. 细胞的增殖、分化、坏死、凋亡在生物体的生命历程中都具有积极意义
C. 细胞分裂伴随个体发育的整个过程中，细胞分化仅发生于胚胎发育阶段
D. 细胞凋亡是受遗传物质控制的正常生理过程，溶酶体在细胞凋亡中起重要作用
7. 根据下图判断下列叙述不正确的是（ ）
A. ①②，①④的根本原因是基因的选择性表达
B. 抑制DNA复制可使①③停止
C. ②、④、⑤细胞中的DNA总含量相同，RNA种类、含量不同
D. ③⑤是以新陈代谢为基础，此时细胞的同化作用大于异化作用
8. 下列属于细胞分化、癌变和衰老的共同表现的是（ ）
A. 细胞的形态、结构和功能发生变化
B. 新陈代谢速度减慢
C. 遗传物质发生改变
D. 细胞膜的通透性改变
9. 下列关于细胞分化、衰老、癌变和凋亡的叙述，错误的是（ ）
A. 细胞凋亡时有些酶的活性会增强
B. 分化和癌变过程中均发生遗传物质的改变
C. 造血干细胞分化成白细胞的过程不可逆
D. 衰老细胞具有水分减少、代谢减慢等特征
10. 正常细胞转变为癌细胞的过程中，不发生改变的是（ ）
A. 细胞中的染色体数 B. 细胞的形态结构
C. 细胞中的遗传物质 D. 细胞的分裂能力
11.下列过程不属于细胞分化的是（ ）
A.淋巴细胞形成浆细胞
B.胚胎干细胞形成神经细胞
C.蜥蜴断尾再生
D.质壁分离植物细胞的复原
12. 根据每个细胞中DNA相对含量不同，将某种连续增殖的动物细胞归为甲、乙、丙三组，每组细胞数如下图l所示。根据细胞中的DNA含量在细胞周期中的变化绘制曲线，如下图2所示。下列有关图的分析，不正确的是（ ）
[细胞中DNA相对含量][细胞数目][DNA相对含量][细胞分裂时期][图1][图2][4
A. 图l中的乙组细胞全部位于图2中的AB段
B. 图l中的丙组细胞全部位于图2中的BC段
C. 图l中的甲组细胞全部位于图2中的DE段
D. 用药物抑制纺锤体的形成，会导致丙组细胞数增多
13. 下列关于哺乳动物胚胎发育和胚胎工程的叙述，正确的是（ ）
A. 卵裂期胚胎中细胞数目和有机物总量在不断增加
B. 胚胎分割时需将原肠胚的内细胞团均等分割
C. 胚胎干细胞具有细胞核大、核仁小和蛋白质合成旺盛等特点
D. 胚胎干细胞是一类未分化细胞，可从早期胚胎中分离获取
14. 下列关于生物工程的叙述中，不正确的是（ ）
A. 利用胚胎移植技术，可以加快优良种畜的繁育
B. 经诱导融合得到的杂种细胞，需经组织培养才能获得杂种植株
C. 人工合成法获得的人胰岛基因与体内该种基因
D. 利用DNA探针可检测出苯丙酮尿症和21三体综合征
15. 作物脱毒、改善畜产品的品质、抗除草剂作物、可保存的干扰素、检测有毒物质、性别鉴定依次是下列哪项生物技术的应用（ ）
①基因工程 ②细胞工程 ③蛋白质工程 ④胚胎工程
A. ②①①③②④ B. ①②②③④④
C. ②①②③②④ D. ②①②④③②
16. 下面为动物机体的细胞凋亡及清除示意图。据图分析，错误的是（ ）
A. ①过程表明细胞凋亡是特异性的，体现了生物膜的信息传递功能
B. 细胞凋亡过程中有新蛋白质合成，体现了基因的选择性表达
C. ②过程中凋亡细胞被吞噬，表明细胞凋亡是细胞被动死亡过程
D. 凋亡相关基因是机体固有的，在动物生长发育过程中发挥重要作用
17. 下列与动物细胞培养有关的表述中，不正确的是（ ）
A. 用胰蛋白酶处理肝组织可获得单个肝细胞
B. 培养液通常含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等
C. 动物细胞培养过程中多数细胞的基因型会发生改变
D. 动物细胞培养可用于检测有毒物质和获得大量自身健康细胞
18. 下列有关减数分裂的叙述，正确的是（ ）
A. 一个精原细胞产生两个相同的概率为1/223
B. 在减数第一次分裂的前期和后期均可能发生基因重组
C. 同一个生物体产生的卵细胞中染色体组成是相同的
D. 经过减数分裂产生的配子，只含有一个染色体
19. 对于转基因生物，那一项不是公众争论的焦点（ ）
A. 食物安全 B. 生物安全
C. 环境安全 D. 伦理道德
20. 在生长激素基因的表达过程中，伴随在细胞内发生的变化，下图中最可能的是（ ）
[时间][相对量][RNA][相对量][ATP][时间] [相对量][DNA][时间][氨基酸相对量][时间][A B C D] [O][O][O][O]
21. 自然界的细胞融合产生有性后代，细胞工程中细胞杂交被广泛应用于培育杂种植株和生产单克隆抗体等方面。请回答以下相关问题：
（1）若a、b分别为和卵细胞，则产生a、b的分裂方式是 。
（2）若a、b表示体细胞，则由d细胞形成杂种植株的原理是 ，其中使用了植物组织培养技术，该技术的中心环节是形成愈伤组织，然后诱导它再分化形成植株，再分化的原理是 ，植物体细胞杂交的意义是该技术能克服 。
（3）生产单克隆抗体时一般不直接培养效应B细胞，主要原因是 ，若用15N标记的氨基酸培养能产生单克隆抗体的细胞，放射性物质在细胞器中出现的先后顺序是 。
22. 下图所示为用两栖动物的卵所做的实验图解，据图回答下列问题：
（1）蝌蚪肠上皮细胞核中含有青蛙发育所需的 ，重新组合的细胞类似于蛙的 细胞，经过 和 形成组织和器官。本实验结果说明 具有全能性。
（2）图中A过程采用的技术手段称作 技术。如果用生物技术使番茄和马铃薯的体细胞融合，首先要获得 ，其方法是 。从理论上讲用融合后的细胞培育出的“番茄―马铃薯”植株是 （可育/不可育）。
（3）上图表示制备单克隆抗体过程。在获得B淋巴细胞之前，小鼠已被多次注射 （相同/不同）抗原，注射后小鼠体内发生相应的 （细胞/体液）免疫反应，生成能产生抗体的B淋巴细胞。
（4）①过程中，常用的与植物细胞融合相同的方法是 诱导融合。融合结果随机出现多种不同的杂交细胞。②过程在特定的 上进行筛选，从而得到 细胞。④培养的气体环境为 。
（5）由于单克隆抗体与传统方法获得抗体相比，具有 的特点，广泛用于疾病的诊断等方面。
23. 图1表示将人成纤维细胞与小鼠细胞进行融合，获得部分杂种细胞的过程（注：杂种细胞中只有人类的染色体会随机丢失，各种杂种细胞保留人类染色体的种类和数量是不同的）。表1表示杂种细胞中基因的存在与人体染色体间的关系。请回答下列问题：
请据图1和表1回答问题：
（1）图1中不同于诱导植物细胞融合的诱导因素是 ，再用特定的 培养基进行筛选，得到杂种细胞。
（2）培养杂种细胞时，根据细胞所需营养物质的种类和数量严格配制培养基，此外经常会在培养基中加入 。培养过程细胞需置于含CO2的混合气体的培养箱中培养，CO2的主要作用是维持培养液的 。
（3）若只考虑人的成纤维细胞与鼠细胞两两融合形成的杂种细胞，假如每种杂种细胞只保留了人的1条染色体，从染色体组成的角度考虑，杂种细胞可能有 种。
（4）据表1 推测，第2染色体上有第 基因，可进一步证明萨顿的假说 （萨顿假说的核心内容）是正确的。人体中，第1基因和第 基因的遗传遵循基因的自由组合定律。
24. 长期以来，优良种畜的繁殖速度始终是限制畜牧养殖业发展的瓶颈，近年来发展起来的细胞工程和胚胎工程技术为优良种畜的快速繁殖带来了无限生机，请据图完成下列问题：
（1）在试管牛和克隆羊的培育过程中都必须用到的生物技术有 、 （至少写出二项）。
（2）和受精有关的过程有：①第一次卵裂开始；②释放第二极体；③顶体反应；④穿越透明带；⑤雌、雄原核的形成；⑥核膜消失，雌、雄原核融合。其正确的顺序为 （填序号）。
（3）超数排卵技术的处理措施是对供体母牛注射 ；冲卵实质上是用特定装置，将供体母牛子宫内的 冲洗出来。
（4）从A到E中，适宜于牛的胚胎移植时期有 ；图中标号3为 ，它将来可发育为胎膜和胚盘。
（5）动物的早期胚胎移植到同种且 与供体相同的动物体内，使之继续发育为新个体的技术叫做胚胎移植。用某染料鉴定胚胎细胞是否为活细胞时，发现活胚胎细胞不能被染色，其原因是活细胞膜 。
（6）试管牛E的性别为 ，克隆羊多利的性状和 最接近，原因是 。
25. 为了研究微生物的抗药性突变是自发产生的还是在环境因素的作用下产生的，1952年Lederberg夫妇利用大肠杆菌设计了一个影印培养法实验。影印培养法的实验原理是把长有数百个菌落的细菌母种培养皿倒置于包有一层灭菌丝绒布的木质圆柱体（直径略小于培养皿平板）上，使其均匀地沾满来自母种培养皿平板上的菌落，然后通过这一“印章”把母板上的菌落“忠实地”一一接种到不同的其他培养基上。下图就是利用影印培养技术证明大肠杆菌产生抗链霉素突变基因的实验。具体方法是：
①首先把大量对链霉素敏感的大肠杆菌涂布在不含链霉素的培养基的平板1的表面，待其长出密集的小菌落后，用影印法接种到不含链霉素的培养基平板2上，随即再影印到含有链霉素的培养基平板3上。经培养后，在平板3上出现了个别抗链霉素的菌落。
②对培养皿2和3进行比较，在平板2上找到与平板3上那几个抗性菌落的“孪生兄弟”。
③把平板2上与平板3上菌落相应的一个部位上的菌落挑至不含链霉素的培养液4中，经培养后，再涂布在平板5上。
④重复以上各步骤，最后在试管12中获得了较纯的抗性菌落。
根据以上材料回答下列问题：
（1）若要仅获得抗链霉素的大肠杆菌，则该如何操作： 。
（2）大肠杆菌抗链霉素基因存在于细胞的 结构上，在基因工程中，该结构常作 。
（3）3号、7号、11号培养皿中加入链霉素的作用是 ，3号培养皿中的菌落比1号、2号中的菌落少很多，这说明了 。
【摘要】 ［目的］探索在旋转生物反应器内，应用微载体技术快速扩增并向软骨分化人脂肪干细胞。［方法］将人脂肪干细胞结合Cytodex3微载体在旋转的生物反应器（RCSS）内进行动态培养，应用倒置显微镜和扫描电镜对微载体表面的脂肪干细胞进行动态观察，并对收获的脂肪干细胞进行SafraninO、toluidine blue染色等组织化学染色及Ⅱ型胶原的免疫化学染色分析。［结果］脂肪干细胞于24 h内贴附于Cytodex3微载体表面，细胞形态为短梭形，随时间的延长，贴附于微载体的细胞逐渐增多，到培养后期，细胞密度可达最初接种的19倍左右，在微载体上收获的细胞进行番红花O、阿利新蓝染色呈阳性，Ⅱ型胶原染色阳性，均强于对照组。［结论］利用微载体细胞培养技术可简便快速地在体外扩增脂肪干细胞，并成功实现向软骨细胞分化。
【关键词】 脂肪干细胞； 生物反应器； 微载体； 软骨细胞
自从2001年Zuk等人［1］从脂肪中提取出了具有多向分化潜能的干细胞后，脂肪干细胞(adipose derived stem cells，ADSCs)以其来源广泛，取材方便，扩增迅速等优点迅速成为了组织工程的研究热点。多项研究证实，ADSCs在体外可以向多种细胞系分化，包括骨、软骨、脂肪、肌肉、神经及内皮［2、3］。其生物学特性与骨髓基质干细胞非常相似，在组织工程领域颇具应用前景。而软骨是公认的最适于应用组织工程技术构建的组织，因此以ADSCs作为软骨组织工程的种子细胞，具有很高的实用价值。构建组织工程软骨通常要求短期内获得大量的种子细胞，并且在体外培养过程中能够保持良好的表型。传统的静态培养方式很难满足这些要求，而立体三维动态培养不但可以加速细胞的增殖，而且利于软骨方向分化及表型的维持［4］。因此，本研究利用生物反应器技术结合微载体对ADSCs进行快速扩增同时向软骨细胞方向诱导，旨在观察ADSCs在微载体上增殖分化情况，探讨其未来临床应用的可行性。
1 材料和方法
1.1 材料
Ⅰ型胶原酶，地塞米松，2磷酸1抗坏血酸，ITS，Cytodex 3(Sigma)，胰酶，高糖DMEM(Gibco)，胎牛血清(元亨圣马)，FGF2、TGFβ1(Peprotech，UK)，Ⅱ型胶原鼠抗人单克隆抗体(北京中山公司)，旋转生物反应器(Synthecon)，Olympus倒置显微镜(Olympus)。
1.2 方法
1.2.1 ADSCs的分离培养 取膝关节置换术中切除的髌下脂肪垫，严格保持无菌，取材后30 min内进行干细胞分离。在超净工作台中，用显微剪刀仔细剔除脂肪组织表面的筋膜和小血管，DHank's冲洗3遍以洗去红细胞的污染。剪碎，加入5倍体积的0.075%的Ⅰ型胶原酶，37℃、搅拌30 min，离心2 000 r/min，5 min，倾去上层脂肪及上清，DHank's洗涤，100目筛网过滤。离心1 000 r/min 5min，沉淀用DHank's洗2遍，将细胞重悬于含10%FBS的高糖DMEM培养基，48 h后换液。细胞长满80%后，用0.25%胰酶消化传代培养。至第2代时，换培养液为软骨诱导液(5 ng/ml FGF2，10 ng/ml TGFβ1，50 μg/ml Vc、10-7M Dexamethasone，1xITS)进行软骨方向诱导分化。
1.2.2 Cytodex 3预处理 取干重微载体珠50 mg，放入10 ml的洁净玻璃瓶中。向瓶中加入不含钙和镁离子的PBS 10 ml，室温下至少孵育3 h以膨胀微载体珠，用巴氏吸管弃去上清液，PBS清洗微载体2次，弃去PBS，再加入新鲜不含钙和镁离子的PBS 10 ml，高压灭菌20 min，吸除上清液，微载体用培养液清洗，置于4℃冰箱中备用。
1.2.3 细胞培养方式 将Cytodex 3微载体50 mg及ADSCs(最终浓度1×105/ml)加入到10 ml体积的RCSS培养容器中，并补加软骨诱导培养基至充满容器。把接种细胞的容器连接于旋转底座。整个装置放于5%CO2孵箱，于37℃常规条件下培养。开始以5 r/min的速度旋转5 min，以充分混合细胞，然后停止旋转5 min。再旋转容器5 min，再停止容器旋转5 min。多次重复循环，最后持续旋转容器并逐步调整转速至10～12 r/min。视培养基颜色及pH值决定是否换液及换液量。ADSCs静止培养是以1×105/ml接种于6孔板中，每孔2 ml，接种5孔，培养过程中每2～3 d更换培养液，保持细胞供养充足。
1.2.4 细胞形态学观察和计数 人ADSCs分别培养1、3、5、7 d，取样本于倒置显微镜下观察微载体表面ADSCs生长形态及增值变化情况，消化、分离微载体表面的软骨细胞并用血细胞计数板计数，描记细胞培养生长曲线。并取第3 d细胞微载体样本，进行扫描电镜观察，观察细胞生长形态及基质分泌情况。对照组静态单层培养的ADSCs细胞，分别于1、3、5、7 d观察细胞生长形态及增值变化情况，并收集一孔细胞计数，描记细胞生长曲线。
1.2.5细胞化学及免疫细胞化学分析分别将微载体上生长的ADSCs和单层培养的ADSCs进行消化收集，爬片，应用SafraninO染色，toluidine blue染色观察细胞外基质中GAG合成和分泌情况。应用Ⅱ型胶原单克隆抗体与细胞爬片共同孵育，以DAB为底物应用免疫过氧化物酶法显色，阳性染色为棕色反应，观察Ⅱ型胶原分泌合成情况。
2 结果
2.1 ADSCs在Cytodex 3微载体表面贴附生长情况
细胞接种3 h后，细胞开始贴附于微载体表面，24 h后，绝大部分细胞已经贴附在微载体表面，培养基中仅可见少量死亡细胞。细胞由球形、半球形逐渐伸展为短梭形，偶见伪足伸出，形态不规则(图1a)。第3 d，微载体表面细胞明显增多，在不同焦距平面上均可见细胞贴附生长，细胞周围可见基质分泌沉淀，微载体间偶见细胞连接。细胞形态呈短梭形扁平状。培养基中少见死亡细胞，电镜扫描，细胞在微载体表面贴附良好(图1b)。第5 d，微载体大部分空间已被细胞所覆盖，细胞层叠生长，大量基质分泌，单个细胞形态不易区分，微载体之间可见宽大的细胞连接体，微载体呈团状生长(图1c)。第7 d，微载体已被完全覆盖，表面细胞互相重叠呈团块状，这使得微载体表面变得粗糙、凹凸不平。微载体间广泛存在细胞连接，培养基中几乎无脱落细胞(图1d)。
2.2 ADSCs在静态培养中生长情况
细胞接种于诱导培养基2 h后，开始贴壁，24 h后全部贴壁。细胞形态为短梭形或多角形，与未诱导ADSCs相比较细胞个体略大。完全贴壁后即开始快速增殖，3 d达到50%融合，5 d达到80%融合。随细胞密度增加，增值速度减慢，7 d基本完全融合。
2.3 2种不同培养方式下ADCSs的生长曲线
在第1、3、5、7d，分别从RCCS容器及普通培养瓶中收集ADSCs并计数，做生长曲线如图2。台盼蓝染色排除试验显示，从微载体上回收ADSCs存活率90%以上。血细胞计数板计数，可见ADSCs于RCSS接种后的第3 d起生长加速，至第7 d细胞密度达到最高值，约为最初接种的19倍。静态单层培养第7 d收获细胞总数约为最初的6倍余。
2.4 细胞化学及免疫细胞化学检查分析
2组不同培养方式的ADSCs爬片染色显示，微载体培养的细胞SafraninO染色，toluidine blue染色呈强阳性，强于静态培养组，表明细胞外基质中含有大量GAG；Ⅱ型胶原染色亦呈强阳性。结果表明微载体上培养的ADSCs经过动态诱导培养，有软骨特征性基质成分表达(图3～5)。
3 讨论
脂肪来源干细胞容易获得，并且来源广泛，与骨髓基质干细胞一样均属于来自中胚层的成体干细胞。De Ugarte等［5］发现来源于骨髓和脂肪组织的干细胞在细胞获得率、细胞老化、基因转染和细胞的黏附特性等方面没有明显的差别。因此，ADSCs作为软骨组织工程的种子细胞，具有不可多得的优势和前景。
作为临床应用，构建组织工程软骨往往需要大量的种子细胞，有研究表明当细胞数量少于1×107/ml时就不能形成软骨或生成很少［6］。传统的培养方式不仅扩增速度慢，而且不容易维持干细胞诱导后的表现；在三维培养条件下则有利于ADSCs向软骨方向分化，并促进细胞外基质的合成［7］；而动态三维立体培养则进一步提高了组织工程软骨的生物化学功能和生物力学功能。
微载体细胞培养技术是一种微载体与生物反应器结合的技术，现已广泛应用于组织工程领域。在动态培养过程中，外部流体力学刺激能够明显增加细胞增殖，促进细胞DNA的合成，利用生物反应器和微载体进行细胞扩增，细胞浓度最高可达到1×108/ml［8，9］。这在常规培养条件下是很难达到的。这首先是由于微载体有较大的表面积(Cytodex 3 110 g提供约4600 cm2的表面积)［2，5］，相同容积的生物反应器和普通培养瓶相比，前者可比后者多培养数10倍甚至100倍的细胞，可以满足较大体积组织构建对种子细胞数量的需求；其次因为整个培养容器由电机驱动沿水平轴旋转，培养基以及细胞颗粒随容器一起旋转，细胞微载体颗粒在水平轴内建立均质的液体悬浮轨道，使细胞所受到的重力、浮力及剪切力达到平衡，这就构成了一种微重力培养环境，利于细胞聚集，并在微载体表面各个方向上均衡扩增生长；最后一点在这种动态环境中，细胞与营养物质易于均质分布，显著改善微环境中的营养物质及代谢产物的交换，保持培养环境的均一性和稳定性，有效促进了细胞的增殖。
组织构建的另一个难题是怎样保持其诱导表型，不发生去分化。生物反应器和微载体介导的动态三维培养，不但为细胞增殖提供了良好的环境，而且周期性的力学刺激作为一种必要的物理信号在细胞的分化过程中起到了重要的作用。在动态环境中细胞活性增强，加之诱导因子的作用，使得大量蛋白合成分泌，形成特异的细胞外基质，促进了细胞的分化和成熟。总之，这种动态培养微环境提供了细胞聚集、快速三维生长和分化的条件，为工程化组织构建提供了更为有效的手段［10］。本实验的结果也证实了这一点，实验中ADSCs在微载体上能够迅速贴附、伸展并快速增殖。第7 d细胞已将微载体表面完全覆盖，并凸出微载体表面生长，微载体间相互连接，呈团状生长。微载体培养在1周的时间内细胞数量增长了近20倍，而静态培养则仅为6倍，组织化学及免疫组织化学均显示微载体培养的细胞有较好的表型及细胞外基质。本研究为以ADCSs作为种子细胞构建组织工程软骨提供了实验依据，为进行更加深入的研究奠定了基础。
参考文献
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[关键词]毛囊干细胞；鉴定；分离培养
[中图分类号]R329.2 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2015）19-0077-04
The cultivation and identification of hair follicle stem cells
XIAO Feng1，TAN Jun2
（Department of Plastic and Laser Aesthetic Surgery，People's Hospital of Hunan Province，Changsha 410000，Hunan，China）
Abstract： Hair follicle stem cells are the ideal seed cells for skin tissue engineering，which has become a hot research topic in recent years.Isolation and identification is the basis of the research. The author will analyze and summarize several methods of isolation and culture of hair follicle stem cells in recent years.It will provide a solid foundation for the further study of hair follicle stem cells.
Key words：hair follicle stem cells；identification；cultivation
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，存在于胚胎及成体内。在一定条件下，干细胞可以无限增殖而保持未分化状态，也可以分化成多种功能细胞。20世纪，Cotsarelis、Taylor等[1]通过相关研究发现，在毛囊上部由外根鞘形成的明显突起，即隆突区域也有干细胞的存在，这些干细胞被定义为毛囊干细胞。毛囊干细胞与其他成体干细胞一样拥有强大的增殖能力及多向分化潜能[2]。毛囊干细胞能通过自身的分裂增殖产生各种机体所需的细胞，以补充脱落和缺失的细胞；毛囊干细胞不仅能够向下转移到毛囊根部生成毛囊，而且还能从毛囊外根鞘向上迁移，生成表皮和皮脂腺，并且能分化形成骨及脂肪[3-4]。近年来，毛囊干细胞的研究备受关注，已成为研究热点之一。目前，存在多种毛囊干细胞的分离培养及鉴定方法，为毛囊干细胞的深入研究提供了坚实的基础，作者就毛囊干细胞常用的分离培养及鉴定作一简要综述。
1 毛囊干细胞的分离纯化
此前，已有许多研究者采用不同的方法来分离毛囊干细胞，并成功地进行传代培养，进行后续更深入的研究。目前对毛囊干细胞分离纯化常用的有以下几种方法：
1.1 组织块培养法
取含有毛囊的皮肤样本，清洁干净，酒精消毒后用PBS液冲洗，将皮肤切成小块，表皮朝上贴于加入适量培养基的培养器皿中，置于5%CO2培养箱中，37℃，饱和湿度条件下培养。组织块培养法分离的干细胞能持续保持增殖趋势，没有明显的平台期，并且随着不断传代纯化，此方法获得的毛囊干细胞纯度明显增加。但是组织块培养法分离获取毛囊干细胞的效率较低。史明艳等[5]使用该方法成功获得毛囊干细胞，并分析指出该方法的优势在于组织块培养时从组织块中迁移出来其他细胞为毛囊干细胞创造了一个类似于体内的微环境，使毛囊干细胞能最大程度地保留增殖分化能力。
1.2 显微分离技术
取含有毛囊的皮肤样本，清洁干净，除去皮下脂肪，酒精消毒后，使用含高浓度青、链霉素的PBS液反复冲洗3次；在超净工作台内，显微镜下显微镊钝性分离单个毛囊组织，收集形态完好且处于生长期的毛囊。收集滤液离心（1 500r/min）10min，弃去上清，加入含培养基培养皿，于37℃、5%CO2孵箱中培养。显微分离技术能从样本直接选取毛囊干细胞相对富集区域，有利于后续进一步的纯化[6]。王祝迁等[7]使用此方法成功分离出大鼠毛囊干细胞，但单纯应用显微分离技术获取高纯度的毛囊干细胞需花费大量的时间和精力，效率偏低。
1.3 酶消化法
取含有待培养毛囊的皮肤样本，清洁干净，酒精消毒后用含双抗PBS液冲洗，将皮肤样本剪成小块，置于中性蛋白酶Ⅱ（0.25g/l）中，37℃摇床消化2h。取出组织用PBS冲洗3遍，置于胰蛋白酶（质量浓度为2.5g/l）和乙二胺四乙酸（0.2g/l）1∶1消化液37℃摇床消化1h后，过200目钢网。收集滤液离心（1 500r/min）10min，弃去上清，加入细胞培养液培养。此方法获得的毛囊干细胞克隆形成能力强，获取效率高。郑宣等[8]用此法获得较纯的毛囊干细胞，但获得的毛囊干细胞经历增殖期后生长速度逐渐减慢，且细胞存活率下降，可能与酶消化法破坏了毛囊干细胞生长微环境有关。
1.4 差数贴壁法
将收集的细胞接种于Ⅳ型胶原包被的培养皿中，静置20min后，收集上层未贴附角质形成细胞和毛囊真皮成纤维细胞于另一培养皿中，贴附皿底的毛囊干细胞，置于体积分数为5%CO2、37℃孵箱中培养，每3d换液一次。与单纯使用某种毛囊干细胞分离方法相比较，联合差数贴壁法将更进一步纯化，获得纯度更高的毛囊干细胞。彭等[9]使用酶消化法联合差数贴壁法获得了形态典型且均匀一致的毛囊干细胞。目前此方法已被广泛使用。
1.5 免疫磁珠法
免疫磁珠法主要用来纯化分离培养获得的毛囊隆突区细胞中某种标记物阳性的细胞。首先制作细胞悬液，并加入FITC标记的某种标记物单抗，室温孵育30min，离心后弃上清中未结合的抗体，加入磁珠分选缓冲液重悬细胞，再次离心后弃上清，PBS缓冲液清洗2次，取重悬后细胞与免疫磁珠混合，室温反应30min。磁珠分离器分离8min，去除未与磁珠结合的细胞。将结合了靶细胞的免疫磁珠用磁珠分选缓冲液洗5次。体积分数为5%CO2、37℃孵箱培养48h，使细胞与磁珠分离，即可获得较纯的毛囊干细胞。谭挺等[10]用此法获得高纯度毛囊干细胞，他们指出此方法与显微分离技术连用有单次操作分离细胞数量大且纯度较高、能与细胞培养、流式细胞术、荧光显微镜等分子生物学技术兼容等特点。黄恩毅等[11]用此法有效分离并成功培养CD34+毛囊干细胞，发现分选后的细胞仍具有较好的活性，且增殖速度快，增殖期长。卢葳等[6]通过实验证实，免疫磁珠分选后毛囊干细胞活力较好，分离获得的毛囊干细胞适合用于细胞培养、诱导等后续试验。
1.6 流式细胞仪分选法
通过毛囊干细胞表达的某些特异性标记物，利用流式细胞仪可以将目的活细胞从异质性细胞群中分离出来，获得较高纯度的特异性细胞。常用的是荧光激活细胞分选器。卢葳等[6]使用流式细胞仪分选CD34+毛囊干细胞，获得的毛囊干细胞纯度很高、污染机会小，但是分选过程费时，细胞分选后活力稍差。此方法适合于需要做免疫组化，蛋白质组织学等对细胞纯度要求高的实验。
2 毛囊干细胞的鉴定
干细胞的鉴定一直是干细胞研究的难点，常用干细胞的标记物辅助方法进行鉴定。毛囊干细胞有多种明确的分子标记物，如CD34、K15、K19 [12]。
2.1 角蛋白家族
角蛋白是外胚层细胞的结构蛋白，广泛存在于生物体的组织结构中。在表皮细胞中，它们以微丝的状态在细胞内形成广泛的网状结构。在上皮组织中有20多种不同种类的角蛋白表达。在表皮细胞中，随着分化程度的不同其所表达的角蛋白也不相同，因此角蛋白常作为毛囊干细胞的鉴定手段。1998年，lyle等[13]通过表达克隆发现K15是毛囊干细胞表面标记之一，此后K15一直被当做较为公认的毛囊干细胞标记物。20世纪末，有研究者通过实验发现滞留细胞所在的毛囊隆突部细强表达K19[14]；同时有实验发现毛囊隆突部K19高表达细胞缺乏特异性分化标志，进一步证实 K19高表达细胞为毛囊干细胞，因此，认为K19也可作为毛囊干细胞表面标记物[15]。在毛囊干细胞分化过程中，K15表达减弱较K19早，K19表达阳性而K15阴性的细胞仍有可能为处于早期阶段的增殖细胞，因此推测，检测毛囊干细胞时K15更准确[13]。
2.2 钙黏蛋白家族
钙黏蛋白是一种同亲型结合、Ca2+依赖的细胞黏着糖蛋白，对胚胎发育中的细胞识别、迁移和组织分化以及成体组织器官构成具有重要作用。不同细胞及发育不同阶段其细胞表面的钙黏蛋白的种类与数量均有所不同，目前已经发现几十种钙黏蛋白。CD34抗原是钙黏蛋白中的一种，是一种高度糖基化Ⅰ型跨膜蛋白，为阶段特异性白细胞分化抗原，CD34表达于人类造血干细胞，CD34是目前公认的造血干细胞标志物。Ohyama等[16]通过对鼠毛囊的研究，发现鼠毛囊中CD34阳性细胞与毛囊隆突部滞留细胞和K15阳性细胞在毛囊处位置一致，提示CD34可能也是可靠的毛囊干细胞标记物。Trempus等[17]通过动物实验首次证实了CD34表达于小鼠毛囊干细胞。但CD34在人毛囊干细胞不表达，Shu Jiang等[18] 通过对人头皮进行原位免疫组化和多色免疫荧光标记，发现CD34特异性表达于毛囊间表皮基底部。
2.3 整合素家族
整合素是机体重要的黏附分子，是广泛存在于动植物细胞表面的一类细胞跨膜蛋白，在细胞与细胞外基质间及细胞与细胞间起黏附作用，整合素是由α和β两个亚单位组成的异源二聚体，它们按不同的组合构成20余种整合素。目前，整合素也被广泛用于毛囊干细胞的鉴定，常用的整合素为整合素β1。1995年，Jones等[19]根据表皮细胞表达整合素β1的水平将其进行分组培养，结果发现整合素β1高表达的表皮细胞比低表达者具有更高的增殖及克隆形成能力。1998年，Watt等[20]发现，富含整合素β1的皮肤基底细胞比整合素β1含量少的皮肤基底细胞能更快速的黏附细胞外基质蛋白，并具有更高的克隆形成能力，上述发现均为整合素β1作为毛囊干细胞特异性表面标记物提供有力支持。
3 结论
综上，目前常用的分离培养方法主要包括：组织块培养法、显微分离技术、酶消化法、差数贴壁法、免疫磁珠法、流式细胞仪分选法，每种方法均有各自的优势及缺陷；组织块培养法简单，但是分离纯度不高，分离效率低下；显微分离技术相对其他方法而言，分离纯度高，但是分离过程比较费时费力；酶消化法效率高，但是酶消化过程同时会破坏细胞微环境，影响细胞存活率；差数贴壁法一般联合其他分离纯化方法，能进一步纯化所获毛囊干细胞；免疫磁珠法获得的毛囊干细胞纯度高、活性强，但是分离方法较复杂；流式细胞仪分选法所获得毛囊干细胞纯度高，但细胞活性低。因此，在选择毛囊干细胞分离培养方法时一定要根据实验的特殊要求及实验条件选择合适的方法。毛囊干细胞的鉴定方法常用的包括：角蛋白家族、钙黏蛋白家族、整合素家族；实验条件允许的情况下，同时检测两种以上的标记物来鉴定毛囊干细胞是较为准确的一种方法。
毛囊干细胞具有其他干细胞的共同特征，具有多向分化潜能。目前，已有实验证实毛囊干细胞能用于尿道缺损、神经损伤的修复；能够分化成为脂肪细胞和成骨细胞[1，21-22]；能有效促进创面愈合，将其作为工程皮肤中的种子细胞，有利于表皮细胞及汗腺、毛囊等附属器官的形成。另外，最新研究表明毛囊干细胞有利于瘢痕的修复，但该研究仍处于起步阶段，相信经过研究者们的不懈努力，其必将为瘢痕治疗这一世界性难题提供一种有效的新方法。
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[关键词] 骨髓基质干细胞；成骨细胞；诱导分化
中图分类号：R681 文献标识码：B 文章编号：2055-5200（2014）02-035-04
前 言
骨髓基质干细胞作为干细胞的一种，具自我更新和多分化潜能，具备成为种子细胞[1-2]的可能，在组织工程发展的热潮中引起科学工作者关注，但围绕骨髓干细胞的相关研究尚处于起步阶段[3-4]。胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）可以通过跨膜的酪氨酸蛋白激酶受体RET激活细胞内多巴胺（DA）神经信号，从而促进神经细胞存活和分化过程。aDA-2006是本实验者在实验中筛选、发现的一种易透过细胞膜、无细胞毒作用、可人工合成的小分子化合物。本实验具体分析DA-2006促进骨髓基质干细胞分化为成骨细胞的机制，为骨组织工程的临床应用提供一定依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验动物：选择南京青龙山的3周龄新西兰大白兔（雄性）。实验试剂与相关仪器：Trizol（美国Invertrogen公司），SYBR Green（日本Toyobo株式会社），反转录试剂盒（日本Toyobo株式会社），0.25% 胰酶（上海生物工程有限公司）、新生牛血清（维森特生物技术有限公司）、细胞孵育箱（赛默飞世尔科技中国有限公司） 、超净工作台（浙江安泰医药有限公司）。
1.2 实验方法
1.2.1 培养方法 脱颈处死大白兔，在75% 酒精中浸泡25-35min后，在兔胫骨结节0.5-1cm处分别抽取骨髓1.5mL，同时加入等体积的DMEM培养液，将液体移至50mL离心管中，1400rpm/min转速离心5-10min，吸去上清及脂肪层，然后在离心管中添加10%FBS的DMEM培养液4 mL，进行颠倒混匀20次，按1×106个细胞/cm2的密度，将细胞接种于10cm细胞培养皿中，置于饱和湿度孵箱（37℃、5%CO2）中培养。经48h细胞培养后，换液50%，去除未贴壁细胞、红细胞等，以后每72h进行一次换液。原代培养9-12d后细胞达80%融合，采用添加0.02%的EDTA的0.25%胰蛋白酶进行消化后传代[2]。
将第2代细胞分3组进行培养，诱导组A采用诱导培养液[4]（普通培养液中添加108mol/L地塞米松，0.01mol/Lβ-甘油磷酸钠，50mg/L维生素C），诱导组B采用含1?LMDA-2006的普通培养液。对照组采用普通培养液。
1.2.2 检测方法 （1） PCR检测标志基因的表达：取传至第3代BMSCs细胞，吸弃培养液，添加1mL冰浴PBS，利用移液器反复轻微吹打细胞，致细胞脱落，1000rpm/min离心细胞收取，转至1.7mL离心管，加入1mL Trizol溶液，加入0.2mL氯仿。Vortex混匀，5min室温静置，然后11000rmp离心，时间为15min。将上层的水相转入到1.5mLEP管，添加等体积异丙醇，Vortex混匀，然后放于-20℃冰箱中，过30min后，11000rmp离心，10min。小心把上清倒掉，保留沉淀。添加1mL 75%的乙醇，然后洗涤RNA沉淀，最后7000rmp离心6min。弃上清，静置5min。
NanoDrop定量后按照TOYOBO 的RT-PCR试剂盒说明书进行。应用Primer Premier 5.0的软件设计、合成ALP、OC、OPN基因引物（上海博尚生物技术有限公司），其特异性利用融解曲线进行分析验证。
cDNA表达丰度采用Ct值进行检测，β-actin的Ct值作为内参。
反转录结束之后，利用SYBR Green（Toyobo）按说明书进行荧光定量PCR。
3步法进行Q-PCR扩增，反应条件如下表1。
表1 Q-PCR扩增条件
温度（°C） 时间（S） 循环次数
95 10 1
92 15 45
60 20 45
72 35 45
（2）MTT法测生长率：各组细胞， 经胰酶消化后， 进行计数， 以2.5*103/L接种于24 孔板中， 每一孔添加250?L，3组均处于37℃、5%CO2 条件下进行培养，在检测前，每孔加入4mg/mLMTT25L，继续培养3h， 吸弃培养液， 每孔添加150?L DMSO，振荡10min， 利用酶联免疫检测仪，在490nm 波长进行检测各孔吸光光度值，每日检测3孔， 进行均值计算。
观察不同组别不同时期细胞的形态学，在3组的第3代传代细胞绘制生长曲线，进行生长率的判断与计算。同时观察不同组别的ALP、OC、OPN基因表达情况。
1.3 统计学处理
采用SPSS软件进行统计处理。所有数据采用x±s显示，组间差异比较，用两样本的均数t 检验，P
2 结果
2.1 细胞形态学情况
细胞生长的形态学特点如下：具有良好状态，具有梭形形状，且放射状生长，细胞间贴附紧密，70%细胞沿细胞体的长轴排列有序（见图1），细胞具有良好的纯度。通过0.25%胰蛋白酶消化后，传代培养的骨髓基质干细胞生长明显速度增加。但传至20代左右，生长速度会逐渐减慢，细胞内产生颗粒状的堆积物。
图1 传代第3代骨髓基质干细胞（×100）
2.2 生长率情况
该实验分为诱导组A，即诱导培养液组，诱导组B，即含DA-2006的培养液组，对照组，即普通培养液组。通过MTT法，在3组的第3代传代细胞绘制生长曲线（见图2）
3组实验进行一周的细胞培养后，3组BMSCs细胞均出现不同程度的团块化，但诱导组B较强于诱导组A，对照组团块化程度最低（B组相比于A组，F=0.152，P=0.453），说明组B的诱导能力高于其他两组，但是无明显差异。
图2 骨髓基质干细胞生长曲线图
2.3 成骨分化标志基因表达情况
标志骨髓基质干细胞的成骨分化的基因有ALP[5]、OC、OPN，这些基因在骨形成中担当着重要作用。通过荧光定量PCR技术，检测这3个标志基因在添加有诱导培养液或者含DA-2006的培养液的条件下的表达变化（见图3）。结果显示对照组的表达量最低，同时组B的ALP、OC、OPN表达量明显高于组A（X2=3.621，6.521，4.052，P=0.012，0.000，0.009）。
图3 骨髓基质干细胞的成骨分化标志基因表达情况
3 讨论
当前骨髓基质干细胞已经被实验证实其作为载体在细胞治疗和基因治疗方面的价值[6-7]。骨髓基质干细胞相对较容易从骨髓中抽取分离，同时较容易进行体外细胞培养及转染多种外源基因。因此，骨髓基质干细胞相比HSCs在基因治疗方面有更多优势[8-10]，例如HSCs的分离需求大量的骨髓，并且这些细胞是很难大批量体外培养的。
经典的诱导骨髓基质干细胞分化成成骨细胞的方法包括流式细胞仪分离技术，密度梯度离心法，贴壁筛选法[11-12]。操作较简单的方法为贴壁筛选法，该法筛选的细胞容易成活。在细胞培养过程中，换液次数减少可以保护骨髓基质干细胞的活力。
多巴胺受体可能作为肿瘤干细胞的生物标志物。将人脐带间充质干细胞诱导分化为多巴胺能神经元并观察其中脑源性神经营养因子的表达情况，研究指出，脐带间充质干细胞经诱导后可向多巴胺能神经元分化，且分化后的细胞可表达脑源性神经营养因子。而对于诱导骨髓基质干细胞分化的方法，目前主要是利用骨形成蛋白或者地塞米松[13]进行诱导，本实验探讨人工合成的小分子化合物DA-2006的诱导作用及其机制。结果显示3组BMSCs细胞均出现不同程度的团块化，但诱导组B较强于诱导组A，对照组团块化程度最低，而且诱导组B的密集程度最高，说明含DA-2006的培养液条件下的骨髓基质干细胞的细胞活性比较强，该结果也验证了增值与分化的矛盾统一原理[14-15]。
人类的骨质是由成骨细胞进行骨质的累积和破骨细胞进行骨质的降解相平衡的一个完美的平衡过程。近年来科学家发现ALP、OC、OPN参与了肿瘤形成、细胞增殖和分化、病毒防御等几乎所有的生物学过程，它可能有非常广泛多样的生物功能。本文通过荧光定量PCR实验，检测骨髓基质干细胞在诱导分化后的相关成骨标志基因的表达变化，可以反应其成骨分化水平，骨碱性磷酸酶（LAP）作为成骨细胞表型的标志物之一[16，17]，可反映成骨细胞的活性和功能状况，主要应用于小儿佝偻病早期诊断，骨源性碱性磷酸酶从骨质中分泌，当骨头中钙盐沉淀出现不足时，分泌会增多，骨中钙盐充足则分泌减少。同时相关研究显示，在干细胞诱导分化为成骨细胞时，OPN与OC的表达水平显著上调。本文结果显示，对照组的表达量最低，同时组B的ALP、OC、OPN表达量明显高于组A。可能机制在于作为干细胞一种开关的多巴胺能控制成骨中新细胞的形成。如果多巴胺信号被抑制，它们就不能产生新的成骨细胞。
总之，本研究探讨了DA-2006对骨髓基质干细胞诱导分化为成骨细胞的作用及分子机制。研究发现在含DA-2006的细胞培养液诱导环境下，骨髓基质干细胞的成骨分化情况较强于经典的地塞米松诱导效果，其机制的发挥可能与上调ALP、OC与OPN的表达水平有关。
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