摘要:目的:模拟miR30的框架结构设计针对HPSE的shRNA,将其克隆至慢病毒载体的CMV启动子调控的表达框内,实现Ⅱ型启动子对RNAi的有效调控。方法:设计3条基于miR30骨架的HPSE—shRNA,通过PCR获得目的片段,回收后与线性化OVPP.GFP载体连接产生重组慢病毒载体LVPP—GFP/miR—HPSE—shRNA,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用LVPP-GFP/miR.HPSE-shRNA、pHelper1.0载体和pHelper2.0载体共转染包装细胞293T细胞,产生慢病毒,感染A375细胞。以实时荧光定量PCR检测HPSE.mRNA的表达情况,以Westenblot检测HPSE蛋白的表达水平。结果:构建出以miR30为骨架的针对HPSE的慢病毒干扰载体,经阳性菌落PCR鉴定与测序,结果正确。实时荧光定量PCR和Westenblot结果表明,LVPP—GFP/miR—HPSE-shRNA重组病毒感染后A375细胞HPSE—mRNA和蛋白的表达明显降低。结论:本研究成功构建了以miR30为骨架的HPSE—shRNA慢病毒载体,实现了Ⅱ型启动子对RNAi的有效调控,为今后实现溶瘤病毒介导RNAi提供了实验依据。
关键词:慢病毒属 遗传载体 rna干扰 微rnas 转录启动子
单位:浙江大学医学院附属第一医院皮肤科; 杭州浙江310003
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