摘要：【目的】研究中华蜜蜂(Apis cerana cerana)抗菌肽Apidaecin在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中的重组表达,并验证纯化后的重组抗菌肽Apidaecin在体内和体外是否具有抗菌活性,为开发新型、安全具有抗菌和免疫调节功能的抗菌肽制剂提供理论依据。【方法】以意大利蜜蜂(Apis mellifera ligustica)Apidaecin为模板,克隆出中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin,成功构建his-pHT43/Apidaecin表达载体,并参照MoBiTec所提供的制备方法成功制得枯草芽孢杆菌感受态细胞,现配现用,以保证其活性并得以在枯草芽孢杆菌表达系统中重组表达。使用His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)进行表达蛋白的分离纯化,使用Easy II Protein QuantitativeKit(BCA)试剂盒测定浓度。纯化得到的重组抗菌肽Apidaecin作用于大肠杆菌K88,在体外进行抑菌圈试验和最小浓度抑菌法测定;在体内,以小鼠为试验动物模型,试验组小鼠腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin,阴性对照组注射相同体积的生理盐水,阳性对照组注射相同体积的头孢霉素,然后人为感染大肠杆菌K88,感染24 h后对小鼠进行解剖,取得肠道样品和血液样品,并从肠道屏障和免疫功能两个方面探讨重组抗菌肽Apidaecin对感染大肠杆菌K88小鼠的保护作用。使用ELISA试剂盒对染菌小鼠血清免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)与肠道sIgA水平进行测定,采用qRT-PCR法对小鼠肠道紧密连接蛋白基因(claudin-1、ZO-2)以及小鼠肠道细胞因子(促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL6和抑炎因子IL10)的转录水平进行测定。【结果】克隆得到的中华蜜蜂Apidaecin含有183bp的碱基,编码60个氨基酸,包含Apidaecin的信号肽序列、一个基础的RR二肽以及抗菌肽Apidaecin的氨基酸序列(内含高度保守的8个氨基酸序列),编码的蛋白质命名为AccApidaecin,其分子量为15.6 kD,等电点为5.33。在IPTG终浓度为3 mmol·L-1,诱导温度为30℃,诱导表达12 h后,可从1 L表达上清中�

关键词：中华蜜蜂 抗菌肽 重组表达 大肠杆菌 抗菌活性 

单位：山东农业大学动物科技学院; 山东泰安271018