摘要：目的寻找休眠结核分枝杆菌复苏的关键基因，探讨结核分枝杆菌复苏的机制。方法取改良7H9培养基培养20d的结核分枝杆菌标准株H37Rv作为对数生长期的活跃结核分枝杆菌，提取其RNA。将一部分该菌株在37℃密封无氧培养45d左右，加入亚甲蓝作为无氧标志，即获得休眠菌。向休眠菌中加入复苏促进因子，37℃有氧培养3d，提取休眠复苏期结核分枝杆菌的基因组RNA。用DNA酶处理RNA并回收RNA，用mRNA纯化试剂盒纯化RNA。利用抑制性消减杂交（Suppression subtractive hybridization，SSH）技术分析休眠复苏期和活跃期结核分枝杆菌的基因组mRNA的表达差异，并通过基因克隆、测序和序列分析，寻找差异表达基因。实时荧光定量PCR鉴定差异表达基因。结果以活跃期结核分枝杆菌cDNA为检测子的正相杂交和以休眠复苏期结核分枝杆菌cDNA为检测子的反相杂交各自高表达或特异性表达的片段都得到了选择性扩增，杂交产物经连接pTA2载体、转化至大肠杆菌DH5α和蓝白斑筛选，正相杂交获得78个阳性菌落，反相杂交获得46个阳性菌落。阳性单个菌落经液体LB培养基培养，以菌液为模板，T7、M13为引物，扩增插入片段，能扩增到明显的条带，且〉350bp的条带为阳性。正相杂交得到66个阳性扩增带，反相杂交得到39个阳性扩增带。这105个阳性扩增带的菌液经测序分析，则正相有30个特异性序列，反相有21个特异性序列。将这51个序列通过Genbank检索，因有不同序列对应同一基因，最后正相获得了20个活跃结核分枝杆菌特异性表达或高表达的功能基因，反相获得了7个休眠复苏期结核分枝杆菌特异性表达或高表达的功能基因，根据其功能不同分为8大类。经实时荧光定量PCR分析，7个休眠复苏期结核分枝杆菌特异性表达或高表达功能基因的表达量均为活跃结核分枝杆菌的该基因表达�

关键词：分枝杆菌 结核 基因 抑制性消减杂交 

单位：北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研究室 101149