【文献标识码】B 【文章编号】1004-7484（2014）02-0728-02
化疗作为恶性肿瘤临床治疗的重要手段而被广泛应用，其所致副反应以白细胞减少最为常见。化疗致白细胞减少易引发感染，导致化疗疗程的推迟与剂量的减小[1]，这不仅影响肿瘤患者的生活质量[2]，还威胁着患者生存周期与预后[3]。因而，化疗所致白细胞减少也就成为临床的常见问题。现代医学对于化疗所致白细胞减少的治疗主要以刺激骨髓造血为主，临床使用的药物以粒细胞集落刺激因子为主。近年来，中药对于化疗后引起的白细胞减少的疗效也逐渐被患者接受，而关于其机制的研究亦逐渐深入。本文就其机制进行探讨。
1 传统中医理论
中医理论认为，化疗药物为热毒之邪，作用于机体导致伤津耗气，阴津亏损，津血同源，气血双亏，阴阳俱虚，脏腑亏损。表现为乏困无力，头晕目眩，夜卧不寐，或失眠多梦，五心烦热，易受外感风寒之邪入侵，属于中医学“虚劳”的范畴，证型多以气血亏虚为主。《灵枢・海论》曰：“髓溢不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧。”《医学入门》曰：“食少神昏，精不荣，腰背胸胁筋骨酸痛，潮汗咳嗽，此虚证也，但见一二便是。”上述描述与白细胞减少的症状相似。中医经典理论认为，虚劳以脾肾虚损为主，肾为先天之本，藏精生髓，肾虚则精髓不生；脾为后天之本，气血生化之源，脾虚则气血生化乏源，气血不足，表现多有乏力、头晕、少气懒言、低热盗汗等症。因此，治疗以补虚为主，针对病因病机，健脾补肾、益气养血等治法对于白细胞减少的治疗有明显疗效。
2 现代医学研究
2.1中药对骨髓细胞增殖的影响
骨髓细胞增殖功能的良好与否决定了外周血象是否正常。骨髓细胞增殖存在细胞周期，而其调控机制中有两个重要的检查点，分别位于G1期与S期、G2期与M期之间。陈志伟等[4]研究显示四物汤配方颗粒各组均能明显促进骨髓G0/G1期细胞向S期细胞以及S期细胞向G2/M期细胞转化，增殖指数（PI）明显升高。郑轶峰等[5-6]研究表明右归丸低、高剂量均能促进骨髓G0/G1期细胞向S期细胞以及S期细胞向G2/M期细胞的转化，提高G2/M期细胞比例，增殖指数（PI）明显升高。左归丸各剂量组均能促进骨髓G0/G1期细胞向S期细胞以及S期细胞向G2/M期细胞的转化，从而导致G2/M期细胞比例和增殖指数（PI）明显升高（P
2.2中药对骨髓造血微环境的影响
造血细胞的存活、增殖、分化、成熟与释放均受骨髓造血诱导微环境的影响，其中，与造血调控密切相关的细胞成分主要是微环境中的巨噬细胞、网状细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、内皮细胞、脂肪细胞等。吴岩等[7]实验发现当归补血汤能够促进内皮细胞由静止期进入增殖期，能促进IL-6和GM-CSF的分泌。当归补血汤通过促进内皮细胞增殖，将内皮细胞分泌的各种造血细胞因子与细胞外基质结合，构成一个支持造血的复杂网络，把造血干细胞固立于局部，使造血干祖细胞受局部高浓度细胞因子的作用而增殖与分化，参与造血调控[8]。
2.3中药对造血因子的影响
骨髓微环境中的基质细胞所分泌的多种细胞因子，如SCF、GM-CSF、G-CSF、M-CSF以及白细胞介素等，这些因子对造血干细胞的增殖、分化和发育起调控作用。IL-6是一种主要由免疫活性细胞分泌的多功能因子，不仅具有免疫调节及抗肿瘤作用，且能促进细胞的增殖分化、加速血小板的再生，具有显著的造血调控作用。袁晓辉[9]研究表明六君子汤能诱导小鼠细胞因子的释放，实验中病理小鼠血液中IL-6活性表现出明显降低，在运用六君子汤治疗后第5、10天具有显著升高IL-6水平。
综上所述，传统中医理论的证候分析及现代医学分子生物学的相关实验研究，均说明中药对于化疗后引起的白细胞减少的治疗有效，而临床大量病例亦证明了化疗后配合中医中药治疗能够改善白细胞减少，提高患者的生存质量。随着肿瘤治疗理念的变化，中医治疗也逐渐成为肿瘤综合治疗中的重要手段被患者所接受。对于化疗引起的其他不良反应，中医中药能否提供更多的有效治疗及其机制有待于我们进一步探讨。
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关键词：胰岛素 前脂肪细胞 增殖 分化
中图分类号：R255.4R587.1文献标识码：B文章编号：1672-1349(2011)05-0545-02
糖尿病的发病率呈现快速增长,胰岛素是糖尿病治疗中不可替代的药物。胰岛素的发展经历了动物胰岛素、基因工程人胰岛素和胰岛素类似物三个阶段。甘精胰岛素和地特胰岛素作为胰岛素类似物出现,已广泛应用于临床［1］。脂肪组织是胰岛素的重要靶器官之一,前脂肪细胞具增殖能力,且能分化为脂肪细胞,作用持续于人的一生,其增殖和分化能力影响脂肪组织的构建。本文拟比较甘精、地特和人胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响,从而指导临床选择不同的胰岛素对糖尿病患者进行个体化治疗。
1资料与方法
1.1主要实验用品及化学试剂DMEM-F12培养基、胰蛋白酶购自Gibco-BRL公司；胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司；青霉素、链霉素购自华北制药厂；噻唑兰、二甲基亚砜、人胰岛素、甲状腺素、地塞米松、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤均购自Sigma公司；油红O染料购自Amersco公司；地特胰岛素由诺和诺德公司提供；甘精胰岛素液体和纯品由甘李药业有限公司提供。
1.2试验方法
1.2.13T3-L1前脂肪细胞的复苏准备37 ℃的温水,从液氮罐中取出冻存管,迅速投入温水中。在水中来回晃冻存管1 min左右,观察到冻存液基本融化。将冻存管中液体吸入离心管中,1 000/min离心5 min,吸弃上清,加入新的培养基,吹打均匀,使得细胞分散,以104/mL密度接种,放入CO2培养箱中培养。
1.2.2MTT法观察前脂肪细胞增殖前脂肪细胞以104/mL接种于96孔板,37℃、5%CO2培养24 h后,设对照组(含10%胎牛血清的D-MEM/F-12配制的完全培养液)和四组干预组(含10 nmol/L甘精纯品胰岛素、人纯品胰岛素、甘体胰岛素、地特液体胰岛素的完全培养液)孵育细胞,隔日一次倒置显微镜下观察细胞并作MTT比色法测增殖。
1.2.3前脂肪细胞分化过程观察前脂肪细胞以104/mL接种于96孔板,D-MEM/F-12(1∶1)基础培养基中添加0.25 μmol/L胰岛素、0.25 μmol/L地塞米松、0.2 nmol/L甲状腺素以及0.5 mmol/L IBMX作分化培养基诱导分化,设对照组(不含胰岛素)和四组干预组(含0.25 μmol/L甘精纯品胰岛素、人纯品胰岛素、甘体胰岛素、地特液体胰岛素的分化培养液),3 d后改用不含IBMX的分化培养基诱导直至14 d,隔日一次显微镜观察。用油红O染色和异丙醇抽提的方法进行细胞内脂质含量定量(以OD值表示)。
1.3统计学处理数据以均数±标准差(x±s)表示,用SPSS 13.0统计学软件处理。多组间应用单因素方差分析,两两之间比较采用LSD-t检验。
2结果
2.1不同胰岛素对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响3T3-L1前脂肪细胞在接种16 h左右基本完全贴壁,显微镜下观察形态类似于成纤维细胞,呈棱形、梭形或多角形,细胞核圆形,位于细胞质中央,使用油红O染色完全不能着色。接种后的第4天进入对数增长期,第10天进入增殖平台期。8 d时地特液体胰岛素抑制细胞的增殖(P
人胰岛素为胰腺β细胞合成和分泌的一种多肽激素,由A链和B链组成,A链含有2 1个氨基酸残基,B链含有30个氨基酸残基。甘精胰岛素是合成的人胰岛素类似物,对结构的改进是将人胰岛素A链21位由甘氨酸取代天冬氨酸,B链末端增加2个精氨酸［2］。地特胰岛素是一种中性的、可溶的、长效胰岛素类似物,它是通过去掉胰岛素肽链上B30位的苏氨酸并通过酰化作用在B29位的赖氨酸上结合了一个14碳的脂肪酸(肉豆蔻酸)而形成［3］。
在增殖实验中,到第8天时地特液体胰岛素开始抑制细胞的增殖直到第12天,第10天时甘精胰岛素促进细胞的增殖。Slieker 等［4］实验表明胰岛素B26-B30 分子结构的改变会影响与IGF-IR 的亲和力,最终影响胰岛素促进有丝分裂的能力。甘精胰岛素因为B链分子结构的改变使其促有丝分裂的能力强于其他胰岛素。Ashish等［6］在观察不同胰岛素对MCF7(乳腺癌细胞)增殖的影响时得出结论,在甘精胰岛素浓度为1.5 nmol/L～1.5 mmol/L时能明显促进细胞增殖,而地特胰岛素浓度在15 nmol/L～1.5 mmol/L时促增殖作用弱于人胰岛素。Mayer等［7］实验表明含甘精胰岛素的血清对MCF7促增殖作用是含人胰岛素血清的1.11倍,而含地特胰岛素的血清为含人胰岛素血清的0.99倍,这与本文得出的结论相似。
在观察不同胰岛素对前脂肪细胞分化影响的实验中,可以看到胰岛素为前脂肪细胞分化的必须试剂,在不含胰岛素的培养基中前脂肪细胞基本不分化。此外,人胰岛素促进前脂肪细胞分化的能力最强,甘精胰岛素次之,地特胰岛素最弱。胰岛素促进脂肪细胞分化是通过包含一系列胰岛素受体底物(IRSs)的信号网络实现的。最早发现体外培养前脂肪细胞的分化需要胰岛素,胰岛素可以提高前脂肪细胞的分化率,胰岛素在前脂肪细胞转化中起相当重要的作用［8］。Kristensen等［9］实验表明胰岛素分子结构的改变会影响与胰岛素受体的结合力,从而影响代谢能力。Peter等［5］也得出结论，人胰岛素与受体结合的能力最强,甘精稍弱,地特的结合能力最差,这可能与其促分化能力不同有关。Staiger 等［10］做出的实验表明小剂量的人胰岛素即可促进前脂肪细胞分化,这与本文结论相似。Anja 等［11］得出结论地特胰岛素小剂量和大剂量对前脂肪细胞分化的影响都低于小剂量的人胰岛素,这与本文结论一致；同时,地特胰岛素对前脂肪细胞分化的影响并非由于B29位结合的肉豆蔻酸改变信号转导通路造成的,机制尚不明确。
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【关键词】血管平滑肌细胞；血管紧张素Ⅱ；增殖
血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的主要功能是通过协调收缩和舒张活动来维持血管张力。VSMCs是许多动脉疾病的细胞水平的根源，其加速生长潜能是血管疾病进展的关键因素。VSMCs表达的蛋白质能促进血管壁的炎症反应，并且与血管疾病的发展有关。人血管平滑肌细胞的体外培养是血管研究中的重要模型，并将对血管疾病的药理学和治疗研究提供大量信息。
血管紧张素Ⅱ（angiotensinII，AngII）是肾素-血管紧张素-醛固酮系统的主要效应因子，是血管紧张素中最重要的组成部分，是由血管紧张素Ⅰ在血管紧张素转化酶的作用下，水解产生的多肽（八肽）物质。人体的血管平滑肌、肾上腺皮质球状带细胞以及脑的一些部位、肾脏器官和心脏的细胞上存在着血管紧张素受体。AngⅡ能与血管紧张素受体结合，作用于血管平滑肌，使全身微动脉收缩，动脉血压升高；而长时间慢性刺激VSMCs可促进其增殖、肥大及衰老[1]。AngⅡ、氧化应激、炎症等因子的共同作用下可导致VSMCs从血管壁的中膜向内膜层迁移，并且不断增殖和合成细胞外基质蛋白，使血管内膜增厚，血管腔变窄，血管弹性降低，最终导致高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病的发生。
1 植物活性成分抑制血管平滑肌细胞增殖
李自立[2]等通过体外培养大鼠胸主动脉VSMCs，检测白藜芦醇和血管紧张素对VSMCs增殖能力的影响。得出结论，白藜芦醇对于VSMCs对于Ang II所诱导的增殖有着较强的抑制效果，不同浓度下作用效果有所差异。王琛[3]等发现姜黄素可通过减少一氧化氮合酶诱导的一氧化氮合成，下调P47phox的表达抑制ROS产生、提高SOD和Gpx的活性，进而抑制Ang II诱导的VSMCs内氧化应激反应。从而具有了抑制Ang II诱导VSMCs的增殖及氧化应激作用。胡娜[4]等通过建立大鼠胸主动脉平滑肌细胞增殖模型，研究香青兰总黄酮对Ang II诱导的大鼠主动脉VSMCs增殖与迁移的作用。通过与对照组比较，Ang II组能显著刺激大鼠VSMCs的增殖和迁移，香青兰总黄酮不同剂量组联合Ang II可在一定程度上抑制Ang II诱导的VSMCs增殖，迁移以及细胞内PCNA的表达，且呈现一定的剂量依赖关系趋势。杨冬梅[5]等发现竹节参皂苷Iva甲酯抑制Ang II诱导的VSMCs增殖与迁移，其机制可能与上调PTEN蛋白，降低NF- kB蛋白表达有关。沈嫣婧[6]等采取组织贴块法培养大鼠主动脉VSMC，研究山核桃叶总黄酮及其4种单体化合物球松素查尔酮、松属素、白杨素、汉黄岑素对Ang II诱导的VSMCs增殖和迁移的作用。得出结论，山核桃叶总黄酮能有效抑制Ang II诱导的VSMC增殖和迁移；白杨素、汉黄岑素、松属素和球松素查尔酮对Ang II诱导的VSMC迁移的抑制作用强于对其诱导的VSMC增殖的抑制作用。侯化化[7]等利用组织块贴壁法培养大鼠胸主动脉VSMCs，通过MTT比色法检测VSMCs的增殖，采用流式细胞仪检测细胞周期。探讨吴茱萸碱对Ang II所致大鼠VSMCs增殖周期的影响，并探讨其机制。发现吴茱萸碱可促进NO的合成、释放，通过阻滞VSMCs与G0/G1期是抑制VSMCs增殖的机制之一。郜攀[8]等体外培养大鼠胸主动脉VSMCs，采用细胞计数法检测VSMCs增殖情况，探讨白藜芦醇对Ang II诱导的VSMCs增殖的影响极其可能机制。实验表明，白藜芦醇可抑制Ang II诱导的VSMCs增殖，其机制可能与腺苷酸活化蛋白激酶的激活有关。刘守钾[9]等探讨毛莨总苷对肾性高血压大鼠的血压、血清一氧化氮、血浆和心肾组织中Ang II以及VSMCs内钙的影响。得出结论，毛莨总苷能降低肾性高血压大鼠的血压，其降压作用可能与其能显著的升高大鼠NO水平及拮抗Ang II引起的VSMCs内钙升高有关。张蕴慧[10]等通过激光共聚焦显微镜技术观察到钩藤碱和异钩藤碱对Ang II诱导的VSMCs[Ca2+]i超载有显著抑制作用。汪云开[11]等观察芍药苷对Ang II刺激下离体大鼠胸动脉平滑肌细胞增殖的影响和基质金属蛋白酶-2活性的影响。发现芍药苷可能通过升高NO和NOS水平抑制Ang II诱导的平滑肌细胞增殖。任艳青[12]等通过原代培养大鼠VSMC，建立Ang II诱导VSMC增殖模型，MTT法观察发现淡豆豉异黄酮抑制Ang II诱导的VSMC增殖作用机制可能与阻止细胞由G0/G1期进入S期，进行VSMC细胞周期的调控有关。杨蕾[13]采用Ang II刺激 A7r5细胞建立细胞增殖模型。采用CCK-8法检测细胞增殖，发现天麻钩藤饮对Ang II诱导VSMCs（A7r5）增殖有抑制作用，升高NO和NOS水平可能是其发挥作用的机制。许银燕[14]等应用MTT法，CellTiter-GloAssay法检测细胞增殖，观察不同浓度的大豆异黄酮对Ang II诱导的大鼠胸主动脉VSMCs增殖的影响。得出结论，大豆异黄酮可呈剂量依耐性的抑制Ang II诱导的VSMC增殖，该作用可能通过上调iNOS基因表达、升高NO水平实现的。
2 药物调控血管平滑肌细胞增殖
钟广伟[15]等研究发现平肝潜阳方可抑制Ang II诱导的VSMCs增殖和迁移，可导致基因组DNA高甲基化，其DNA甲基化水平改变可能与DNA甲基转移酶1表达有关。梁瑞峰[16]等采用组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞，结果与模型对照组比较，15%的降压宝蓝片含药血清可抑制Ang II诱导的平滑肌细胞增殖和迁移。张乐[17]等研究油酰乙醇胺对Ang II刺激大鼠主动脉VSMCs增殖的抑制作用以及对P38信号通路的影响。得出结论，油酰乙醇胺对VSMCs的增殖有抑制作用，其机制可能是抑制了p38MAPK信号通路。邱敏[18]等观察萘哌地尔衍生物YM Ⅲ对Ang II诱导的自发性高血压大鼠VSMC增殖的影响，并初探其作用机制。发现YM Ⅲ可明显抑制Ang II诱导的自发性高血压大鼠 VSMC增殖，作用机制可能与其抑制Agt、c-myc mRNA表达，从而抑制细胞DNA合成和细胞周期的进展有关。邓志生[19]等探讨吡哆胺对Ang II诱导的自发性高血压大鼠VSMCs增殖的影响极其作用机制。实验结果表明，吡哆胺可能通过抑制晚期糖基化终产物的形成、降低胞内活性氧簇水平，减少晚期糖基化终产物受体、核因子кBP65、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸氧化酶P47 phox表达，从而有效抑制Ang II诱导的VSMCs增殖作用。郭玉璜[20]等^察不同类型的降压药物对自发性高血压大鼠（SHR）动脉VSMCs钠泵、钙泵活性及分泌Ang II的影响。发现萘诺普利、伊贝沙坦和氨氯地平能提高SHR动脉VSMCs膜离子泵活性，并影响其分泌Ang II。任利群[21]等探讨罗格列酮对Ang II诱导的VSMCs增殖的影响及可能的机制。得出结论，罗格列酮至少部分通过上调Ang II2型受体表达，阻止VSMCs从G0/G1向S期、G2/M期转化，从而抑制Ang II诱导VSMCs的增殖、迁移，发挥血管保护作用。罗延福[22]等探讨阿托伐他汀钙对Ang II诱导的高血压患者肠系膜动脉平滑肌细胞内NADPH氧化酶-活性氧通路传导和促细胞增殖的干预作用。结果表明，阿托伐他汀钙可以部分抑制高血压患者体内Ang II的促平滑肌细胞增殖及诱导细胞内NADPH氧化酶-活性氧通路。
3 蛋白质调控血管平滑肌细胞增殖
张晓一[23]等探讨胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）和p38丝裂原激活蛋白激酶（p38MAPK）在降钙素基因相关肽（CGRP）和Ang II诱导血管平滑肌细胞NADPH氧化酶-1（Nox1）表达中的作用。发现Ang II诱导A10VSMC的增殖与激活Nox1有关，CGRP抑制Ang II诱导的Nox1表达，可能主要通过抑制p38MAPK信号途径发挥作用，而与ERK1/2信号途径无显著关系。高飞[24]等研究了过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂罗格列酮对Ang II诱导小鼠VSMCs表型转化的抑制所用及其可能的机制。得出结论，罗格列酮通过激活PPAR-γ来抑制Ang II诱导VSMCs的表型转化，激活PPAR-γ可能通过上调PKG I α表达发挥上述作用。孙艳香[25]等观察Ang II1型受体自身抗体（AT1-AA）与动脉粥样硬化动物模型粥样斑块局部炎症之间的关系。发现AT1-AA可明显促进高脂喂养兔受损动脉内膜处斑块形成，增强斑块局部炎症反应的发生及细胞增殖。胡耀东[26]等观察脂联素（APN）对Ang II诱导人颈动脉平滑肌细胞α-SMA表达及增值的影响。发现APN可抑制Ang II诱导人颈动脉平滑肌细胞的分化和增值。吴新宁[27]等检测检测小鼠VSMCs中Sirtuin3（Sirt3）的表达，探讨Sirt3在Ang II诱导小鼠VSMCs增殖中的作用。发现小鼠VSMCs中有一定量的Sirt3表达，Ang II刺激可使Sirt3 mRNA水平和蛋白表达量明显升高；Sirt3可抑制Ang II诱导的VSMCs增殖。姚华丽[28]等探讨Ang II诱导大鼠主动脉平滑肌细胞（VSMC）单核细胞趋化蛋白1（MCP-1）表达的分子机制及生物学功能。结果显示，Ang II通过AT1R，活化SAPK/JNK和ERK1/2激酶途径上调大鼠VSMC MCP-1的表达，并且MCP-1在一定程度上介导Ang II的促平滑肌细胞增殖。程江华[29]等观察多巴胺D4受体对Ang II介导的VSMCs增殖的影响。得出结论，D4受体对Ang II介导的VSMCs增殖具有抑制作用，该作用可能一定程度上抑制了高血压病所伴发的VSMCs增殖。
4 展望
VSMCs增殖所致的血管重塑是高血压等疾病的重要病理变化，也是高血压病情恶化的结构基础。近年来，随着对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞增殖相关调控因素的广泛深入研究，尤其是参与机制的进一步阐明，寻找既可降压又能抑制VSMCs增殖的药物，是预防和治疗高血压等疾病的重要策略。
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【关键词】 重组人表皮细胞生长因子；人表皮细胞；增殖
细胞增殖、分化、成熟的调控依赖多种活性蛋白质及多肽，统称为生长因子。目前已发现包括表皮生长因子(epidermal growth factor, egf)在内的多种生长因子。重组人表皮生长因子(recombinant human egf，rhegf)是通过人工合成的表皮生长因子基因片段在大肠杆菌表达系统进行有效表达而获得的可促进多类细胞生长的多肽类物质, 其活性和结构与天然产物高度一致[1]。具有广泛的促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较大的临床应用价值。在制备过程中不同的提取以及纯化方法对多肽的活性影响较大，本文就应用细菌发酵法获得的rhegf对人表皮细胞的增殖作用进行研究。
1材料及方法
1.1试剂
重组人表皮生长因子，细菌发酵法获得。dmem、prmi?1640培养基为美国gibeo产品，小牛血清、胎牛血清为成都哈里生物工程有限公司；mtt为美国sigma产品。
1.2实验方法及结果
1.2.1表皮细胞取材以及培养包皮环切术后标本，pbs洗涤三次，眼科剪剔除多于皮下组织；25%trypsin冷消化过夜，分离表皮与真皮，并去除真皮，制备细胞悬液；1000 rpm×10 min离心，去上清，培养基重新混悬细胞沉淀，用血细胞计数仪计数，并用台盼兰染色，了解细胞存活率。将上述细胞悬液按一定细胞密度接种于培养皿中，置37 ℃，5%co2孵箱中；2天～3天换液一次；当细胞长满瓶皿70～80%时，根据需要传代或冻存细胞。
1.2.2mtt 法测定细胞的增殖取对数生长期细胞1.5×105接种于96 孔培养板内，每孔100 μl，设6 个复孔。加rhegf使浓度为 0,5,10，20,50,100 ng·ml-1及调零孔加100 μl培养液，继续培养48 h，结束前4 h，加10 μl mtt,常规终止实验，与酶联免疫检测仪上测各孔吸光值，波长490 nm。按下列公式计算相对增殖率（relative growth rate, rgr）：rgr = 给药孔吸光度值/对照孔吸光度值×100%。
1.2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达接种2×105个细胞于75ml培养瓶中，待细胞贴壁后加入不同浓度的rhegf作用于细胞48小时，收集细胞，流式细胞仪检测细胞的增殖，根据细胞周期时相，计算细胞的增殖指数（pi）：pi=(s+g2/m) / (g0/g1+s+g2/m)×100% 。基因产物表达含量分析：上机检测前用pbs 洗离心除去固定液，冰冷pbs 洗涤细胞3 次，按免疫组化方法分别加入c?myc, c?fos和c?jun单抗,使用浓度1∶100，然后加入荧光素标记的二抗igg,37 ℃作用30分钟，pbs洗涤，400目筛网过滤，流式细胞仪上机检测。bios consort30软件系统处理数据，计算阳性细胞标记率，结果扫描图和数据表示方式显示并打印。统计分析处理（x2检验）比较阴性对照组细胞和试验组细胞间有无显著性差异。
2 结果
2.1 细胞形态学观察
光学显微镜下，正常生长的细胞大多呈椭圆形，胞体较大，界限清楚（图1）。
图1 表皮细胞正常光镜图
2.2重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响
通过mtt 法测定细胞的增殖，rhegf在浓度为5～100 ng·ml-1均可以促进人表皮细胞的生长，在10 ng·ml-1时促进细胞的生长作用最为明显。
图2 重组人表皮细胞生长因子对表皮细胞增殖率的影响
2.3流式细胞仪检测细胞周期以及蛋白的表达
rhegf处理组的细胞在dna合成前期减少，而处于dna合成期的细胞增加，增殖率较对照组明显增高, s和g2/m期细胞数增加，g0/g1细胞数减少。表明重组人表皮细胞生长因子可以促进表皮细胞的分裂增殖。基因产物表达含量分析，rhegf处理细胞后与细胞生长相关基因的表达出现明显的变化，c?myc的标记率和表达量明显升高, c?fos和c?jun表达量也明显升高，结果见图3。
图3重组人表皮细胞生长因子对细胞增殖指数及细胞生长相关基因的蛋白表达
2讨论
表皮生长因子（egf）是广泛存在于人体多种组织的一种多肽因子，具有刺激上皮细胞增生，加快创伤愈合的作用[1]。随着分子生物学的研究进展,人们对创面愈合的调控机制认识不断深化。愈合能力差除与创面产生原因有关外,还与创面本身修复内环境的改变、内源性生长因子含量低下或受体活性下调等因素有关。生长因子在创伤修复中起着举足轻重的作用,调控着创伤的修复。egf与其受体结合可激活直接调控或诱导细胞增殖的调节生长基因，参与体表创伤的愈合过程，并且为表皮的高速更新所必须。在创伤修复过程中，由于机体本身对创伤部位的修复机制，内源性egf在创面明显积累，但由于组织中的egf含量普遍较低，难以满足细胞增殖和肉芽组织发育的需要，因此，理论上外源性的egf可加速创面的愈合速度[3]。 重组人表皮生长因子利用基因重组技术人工合成，其结构与天然产物一致，具有促进细胞增殖和组织再生的生物学活性，对体表创伤、烧伤和溃疡等创面的治疗具有较好的临床应用价值。我们研究表明，应用细菌发酵法获得的rhegf对人表皮细胞具有增殖作用，而且在10 ng·ml-1时作用最为明显。流式细胞术的进一步研究表明rhegf处理细胞48h后处于dna合成期的细胞增加，细胞增殖率分别较阴性对照组增加。研究发现c?myc基因与细胞增殖有关，并且与不同的基因群协同控制细胞增殖与分化，参与细胞的调控特别是g0～g1期的过渡。c?fos基因蛋白c?fos可以识别和结合到基因组定的调控序列，从而调控细胞的增殖和分化。c?jun所编码的蛋白质对细胞增殖分化中必不可少的基因表达进行调控。我们的研究表明，rhegf处理表皮细胞后c?myc的标记率和表达量明显升高, c?fos和c?jun表达量也明显升高，提示rhegf可以通过与细胞周期有关的基因促进细胞的分裂增殖。
【参考文献】
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目的：探讨尾加压素Ⅱ (urotensin Ⅱ, U?Ⅱ) 促进晶状体上皮细胞（lens epithelial cell, LEC）增殖的细胞信号转导机制。方法：采用U?Ⅱ与体外培养的LEC共同孵育，并用4种细胞信号转导阻断剂H7，PD98059，W7，尼卡地平 (nicardipine) 分别作用于LEC，再用3H –胸腺嘧啶（3H?TdR）掺入法检测LEC增殖的情况。结果：U?Ⅱ组LEC的3H掺入放射活性显著高于对照组(P<0.01)，4种信号转导阻断剂组的放射活性与U?Ⅱ组比较均有不同程度的降低(P<0.01，P<0.01)。PD98059 和H7 的阻断作用强于nicardipine 和W7（F= 13.251，P<0.01）。 结论：尾加压素Ⅱ促进LEC增殖是通过细胞信号转导的机制，该作用可被信号转导阻断剂所阻断。学术
【关键词】 尾加压素Ⅱ；晶状体上皮细胞；增殖；细胞信号转导；后发性白内障
Abstract?AIM：To study the mechanism on signal transduction of proliferation induced by urotensin?Ⅱ(U?Ⅱ)in lens epithelial cell（LEC）. METHODS：U?Ⅱ were incubated with cultured LEC. Meanwhile four blockers of signal transduction, H7, PD98059, W7 and nicardipine, were incubated with LEC separately. Then the proliferations of LEC were detected via 3H?TdR incorporation. RESULTS：The radioactivity of 3H?TdR in U?Ⅱ group was higher than that in control group(P<0.01). The radioactivities of 3H?TdR in groups of four blockers decreased in varying degrees compared with U?Ⅱ group(P<0.01，P<0.01). The blocking effects of PD98059 and H7 were higher than that of nicardipine and W7（F= 13.251，P<0.01）. CONCLUSION：U?Ⅱ induced LEC proliferation by means of signal trasduction which can be blocked by four signal transduction blockers. The result provides a new thinking for prevention and treatment of after cataract.
?
KEYWORS：urotensin Ⅱ; lens epithelial cell; proliferation; signal transduction; after cataract
0 引言
尾加压素Ⅱ（urotensin Ⅱ, U?Ⅱ）是一种具有多种生物学效应的新型生物活性物质。最早由Coulouarn于1998年从人体中克隆出人U?Ⅱ（human urotensin Ⅱ, hU?Ⅱ）[1]。此后的研究表明，体内多种组织中含有U?Ⅱ。U?Ⅱ不仅具有强烈的缩血管作用[2] ，而且具有促进细胞增殖的作用，可使大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞和血管平滑肌细胞等发生增殖[3]。我们曾发现眼部各组织均含有U? Ⅱ，并发现U?Ⅱ具有促进晶状体上皮细胞（lens epithelial cell, LEC）增殖的作用。后发性白内障 (after cataract)是白内障囊外摘除联合人工晶状体植入术后的主要并发症。其病理生理机制是手术后残留的LEC发生增殖、移行，使晶状体后囊膜发生混浊导致视力再度下降。我们拟探讨U?Ⅱ促进LEC增殖的细胞信号转导机制，为防治后发性白内障寻求新的途径。
1 材料和方法
学术
1.1 材料
无菌操作取健康新鲜小牛眼的晶状体前囊膜，用胰蛋白酶消化法，在37℃，5%CO2培养箱中进行晶状体上皮细胞原代和传代培养，取第3代细胞进行如下实验。hU?Ⅱ，H7，PD98059，W7，尼卡地平(nicardipine)均系美国Sigma公司产品，DMEM培养基为美国GIBCO公司产品， 3H –胸腺嘧啶（3H?TdR）购自上海原子核研究所，2,5?二苯基恶唑（PPO）及1,4?双?（5?苯基恶唑基?2）?苯（POPOP）为中国医药集团上海化学试剂公司产品，胰蛋白酶（trypsin）购自华美生物工程公司，胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，冰醋酸、二甲苯为市售分析纯产品。本研究采用CO2培养箱（美国FORMA 2111）、倒置研究显微镜（日本Olympus IMT?413）、低温冰箱（日本MDF?V5410）、真空泵（美国Nulgene EF006）、微量移液器（法国Gilson）、γ?液闪计数仪（西安FJ2003PS）。
1.2 方法
将实验分成6组，每组8个样本。对照组在LEC中加入胎牛血清和DMEM培养液。U?Ⅱ组在对照组的基础上加入终浓度为10?8mol/L的 U?Ⅱ。H7组、PD98059组、W7组和尼卡地平组分别在U?Ⅱ组的基础上加入4种细胞信号转导阻断剂，终浓度分别为H7 10?5mol/L，PD98059 10?5mol/L，W7 10?6mol/L，Nicardipine 10?5mol/L。取第3代培养的LEC并使细胞生长同步化。在CO2培养箱中继续培养12h后，按照上述实验分组，分别加入hU?Ⅱ和 H7，PD98059，W7和尼卡地平。将LEC在CO2培养箱中继续培养12h后，吸去培养液，每孔分别加入3H?TdR（其放射比活性为每孔 3.7×104个/min），继续培养12h。吸去培养液，消化细胞并用真空泵抽滤，将细胞收集于玻璃纤维膜上。于60℃,30min条件下烘干滤膜，用液闪计数仪测定 3H放射活性。
统计学分析：用SPSS 12.0统计软件分析。所有结果用均数± 标准差（ ±s）表示。各组与对照组间数据比较采用t检验，各组间数据比较采用单因素方差One?Way ANOVA分析。
2 结果
U?Ⅱ组LEC的3H掺入放射活性（个/min）显著高于对照组 (2027.4±109.1 vs 1203.8±107.6，P<0.01)，说明U?Ⅱ使LEC发生明显的增殖。4种信号转导阻断剂组的放射活性与U?Ⅱ组比较均有不同程度的降低 (1819.6±47.2，1759.1±169.0，1557.9±71.9，1442.9±192.4，P<0.01, P<0.01)，显示这4组LEC的增殖减少，表明4种阻断剂均不同程度地阻断了U?Ⅱ促进LEC增殖的信号转导途径。在4种阻断剂中，PD98059组和H7 组的放射活性显著低于W7组和Nicardipine组（F=13.251，P<0.01），表明PD98059组和H7 组对U?Ⅱ促进LEC增殖的细胞信号转导途径的阻断作用更强（表1）。表13H?TdR掺入法检测4种信号转导阻断剂对U?Ⅱ诱导LEC增殖的影响 (略)
3 讨论
U?Ⅱ是一种生长抑素样环型结构的神经肽，最早提取自鱼的尾部下垂体，1998年首次从人体克隆出来。研究表明，U?Ⅱ是具有多种生物学效应的新型生物活性物质，具有较强的促进多种细胞增殖的作用。U?Ⅱ可刺激离体培养的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)发生增殖，呈浓度依赖关系；降钙素基因相关肽、肾上腺髓质素、IL?10等均能抑制由U?Ⅱ诱导的VSMC增殖；U?Ⅱ上调VSMC内皮素基因表达并促进VSMC内皮素的合成释放；肾上腺髓质素可浓度依赖性地抑制U?Ⅱ刺激的VSMC内皮素mRNA水平的增加[4?6]。还有报道U?Ⅱ能促进实验大鼠心肌成纤维细胞、气道平滑肌细胞、肾系膜细胞发生增殖，且在一定的浓度范围内其促增殖作用具有浓度依赖性。有关U?Ⅱ促进细胞增殖作用的细胞信号转导机制已有报道[7]，U?Ⅱ促进细胞增殖的途径与Ca2+介导的信号转导通路有密切关系。另有文献指出[8]，抑制与有丝分裂有关的多种信号蛋白分子，如c?src，PKC(protein kinase C)，CaM?PK，MAPK(mitogen activated protein kinase)，钙调神经磷酸酶(CaN)，均可在不同程度上抑制U?Ⅱ的有丝分裂效应，从而抑制U?Ⅱ刺激细胞增殖的作用。Watanabe等[9] 研究发现，PKCCaMGPCRMAPK的阻断剂可抑制U?Ⅱ对VSMC的增殖作用，从而间接表明U?Ⅱ是通过PKCCaMGPCRMAPK信号转导途径发挥其促增殖的作用。
学术
我们曾发现，眼内各组织中均有一定量的U?Ⅱ，U?Ⅱ能显著促进LEC发生明显的增殖并呈浓度依赖关系。在此基础上，我们采用3H?TdR掺入法检测4种细胞信号转导阻断剂对U?Ⅱ促进LEC增殖的影响，以探讨U?Ⅱ促进LEC 增殖的信号转导机制。这4种信号转导阻断剂中，H7是蛋白激酶C（PKC）抑制剂，PD98059是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）抑制剂，W7是钙调素（CaM）抑制剂，尼卡地平(Nicardipine)是钙通道阻滞剂。研究结果发现，4种信号转导阻断剂均能降低LEC的放射活性、阻断U?Ⅱ促进 LEC增殖的信号转导通路，使U?Ⅱ促进LEC增殖的作用减弱。间接表明U?Ⅱ是通过DG蛋白激酶C途径、受体酪氨酸蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶途径、 Ca2+和钙调蛋白激酶途径等细胞信号转导途径发挥其促进LEC增殖的作用，从而探明了U?Ⅱ促进LEC增殖的细胞信号转导机制。
白内障囊外摘除联合人工晶状体植入手术后残留的LEC发生增殖，并移行至后囊下形成再生的晶状体结构如珍珠样（Elschnig）小体及 Soemmering环，再向成纤维细胞转化、分泌胶原形成纤维膜, 使晶状体后囊膜发生混浊，导致白内障术后视力再度下降。这是后发性白内障的主要病理生理过程。我们的前期研究发现U?Ⅱ能促进LEC增殖，提出其很可能是后发性白内障的一个重要发生机制。我们的研究结果发现，4种细胞信号转导阻断剂均能阻断U?Ⅱ促进LEC增殖的信号转导通路，使U?Ⅱ促进LEC增殖作用减弱。该结果一方面表明U?Ⅱ促进LEC增殖的作用及其细胞信号转导机制，阐明了后发性白内障发生发展的可能机制；另一方面揭示采用信号转导阻断剂可阻断U?Ⅱ促LEC增殖作用，减少白内障手术后的后囊膜混浊，提出这可能是防治后发性白内障的一个新途径。经广泛查阅国内外文献，有关U?Ⅱ促进晶状体上皮细胞等眼内组织细胞增殖的研究尚未见报道，更未见U?Ⅱ促进LEC增殖作用的细胞信号转导机制的研究报道，本研究具有一定的科学意义和应用前景。
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学术
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【关键词】 姜黄素； 碱性成纤维细胞生长因子； 视网膜色素上皮细胞
中图分类号 R774.1 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2014）7-0148-02
姜黄素具有抗感染、抗氧化、抗增殖作用，还可以抑制肿瘤细胞生长，诱导肿瘤细胞凋亡，可以抑制RPE细胞的增殖。本实验观察姜黄素对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）促进人RPE增殖的影响，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 RPE细胞
来源于笔者所在医院孕24周以上引产胎儿眼。
1.2 试剂
改良的Eagle培养基干粉（DMEM，美国Gibco公司生产）、胰蛋白酶（美国Sigma公司生产）、新生小牛血清（武汉博士德生物工程有限公司生产）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） （美国Promega公司生产）、姜黄素（成都司科华生物技术有限公司生产），其余试剂为国产分析纯。
1.3 实验仪器
低温高速离心机5417R型（德国Epondof公司生产）、CO2恒温培养箱MCO175型（日本SANYO公司生产）、相差显微镜（上海团结仪器制造厂生产）、全自动酶标仪960型（美国Sigma公司生产）、超低温冰箱（日本SANYO公司生产）、荧光倒置显微镜U-LH100HG型（日本Olympus公司生产）。
1.4 方法
1.4.1 人RPE细胞的获取 人RPE细胞取自供体眼球，在无菌条件下剖开眼球，弃去玻璃体和视网膜神经上皮，剪除神经上皮，制成眼杯。用PBS液漂洗眼杯，加2 ml 0.25%胰酶消化液，10 min后，吸出消化液，再加入2 ml消化液，在37 ℃条件下消化30 min，将所得细胞悬液加入含15%小牛血清培养基的离心管中。1000 r/min离心5 min后，弃上清，漂洗，加入5 ml含15%小牛血清的DMEM培养瓶中，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，根据培养液颜色决定换液时间，待细胞生长至融合状态后开始常规传代，取第二代RPE细胞进行鉴定。
1.4.2 姜黄素对RPE细胞增殖的影响 采用MTT法检测，取第四代RPE细胞用1%小牛血清的DMEM稀释成1×105个/ml的细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔100 μl，置于37 ℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中，培养24 h后换液。本研究设空白组（加入1%小牛血清培养液）、对照组（加入1%小牛血清及5 ng/ml bFGF的DMEM培养液）和实验组（加入1%小牛血清、5 ng/ml bFGF及加入5、10、20 mg/L姜黄素的DMEM培养液）。分别培养24 h和48 h后每孔中加入200 μl MTT继续培养4 h，吸出上清液，加入150 μl DMSO，慢慢振荡使MTT完全溶解，使用自动酶标检测仪测定各孔吸光度（A）值。实验每组设3个平行样，重复3次。增殖抑制率=（对照组A值-实验组A值）/对照组A值×100%。
1.4.3 细胞形态学观察 在相差显微镜下观察细胞形态。
1.5 统计学处理
所得数据采用SPSS 16.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验，计数资料采用字2检验，P
2 结果
2.1 RPE细胞培养及鉴定
在相差显微镜下初次分离的原代 RPE 细胞呈球形，胞浆中可看到大量黑色素颗粒，胞核透明。培养2～4 d后细胞贴壁变扁平，开始伸出伪足，呈不规则多角形，形态均一。传代后，胞浆中色素颗粒开始减少，传至3～4代后，胞浆内的黑色素颗粒消失，细胞向梭形方向发展。第4代RPE细胞经鼠抗人角蛋白染色鉴定，纯度>95%。
2.2 姜黄素对RPE细胞形态的影响
正常培养的RPE细胞呈现多角形、梭形或扁圆形贴壁生长，bFGF处理组可见细胞增殖较快。加入5 mg/L姜黄素组24 h和48 h细胞形态未见明显异常，加入10 mg/L处理组24 h和加入20 mg/L处理组12 h可见有细胞表面变粗糙、折光性变差，随着时间延长细胞结构变的不清楚，有的皱缩、脱壁。
2.3 姜黄素对RPE细胞增殖的影响
MTT检测结果可以看出，5 mg/L处理组24、48 h和10 mg/L处理组 24 h对bFGF促进的RPE细胞增殖未见明显的抑制作用，10 mg/L处理组48 h和20 mg/L处理组24、48 h均能显著抑制bFGF诱导的RPE增殖（P
3 讨论
孔源性视网膜脱离复位手术后视网膜表面发生的广泛纤维增殖，引起视网膜收缩、牵拉，进而引起脱离称为增生性玻璃体视网膜病变（PVR）。增殖的纤维膜主要由色素上皮细胞（RPE）、纤维细胞、成纤维细胞、胶质细胞和巨噬细胞构成，其中最主要的为色素上皮细胞。研究发现，生长因子、白细胞介素、黏附分子等都参与调节RPE细胞和成纤维细胞的迁移与增殖，可以用药物抑制细胞增生而达到预防PVR的发生[1]。
姜黄素具有抗感染、抗氧化、抗增殖作用，其对RPE细胞也有抑制作用。龚凌等[2]研究发现姜黄素对体外培养的人胚眼RPE细胞的增殖有抑制作用，且抑制作用具有时间依赖性[3]。研究发现，在视网膜脱离合并PVR患者的玻璃体液中碱性成纤维生长因子（bFGF）含量增高，并且bFGF对RPE细胞增殖有促进作用[4]，所以本实验中模拟使用bFGF促进RPE细胞的增殖，具有代表性。本研究中，在24 h时，姜黄素浓度为10、20 mg/L组均能抑制bFGF所促进的人RPE细胞的增殖。48 h时5、10、20 mg/L姜黄素亦能抑制bFGF所促进的人RPE细胞的增殖。说明低浓度姜黄素即对bFGF所促进的人RPE细胞的增殖有抑制作用，但是本研究未对细胞毒作用做观察，同时姜黄素对不同种属、不同来源的细胞有无抑制作用也未做观察，有待进一步研究。
参考文献
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【关键词】 鹿茸多肽；大鼠；软骨细胞；增殖
Abstract Objective: The purpose of the present was to investigate the effect of pilose antler polypeptides(PAP) on the proliferation of rat chondrocyte in vitro.Methods: The rat articular chondrocytes were isolated by enzyme digestion and sub-cultivated in serial.The 4th chondrocyte was interfered with PAP.The chondrocytes of different generations and the 4th medicine intefered generation were detected with the methods of proliferating cell nuclear antigen ， MTT(methyl thiazolyl tetrazolium) assay for proliferation and Flow cytometry for analyses of cell cycle distribution and PI(proliferation index).Results: With chondrocytes passage time increasing， the proliferating ability of chondrocytes descended.MTT assay showed that the proliferating ability of chondrocytes decreased， the expression of PCNA tapered in the experiment of immunohistochemistry， and PI descended in flow cytometry for analyses.PAP can inhibit the tendency and strengthen the proliferating ability of chondrocytes in serial subcultivation.Conclusion: PAP can significantly improve proliferation of chondrocytes in serial subcultivation.
Key words Pilose antler polypeptides(PAP); Rat; Chondrocyte; Proliferation
关节软骨缺损是临床上常见的损伤，它可导致关节面不平整，从而继发骨性关节炎。用组织工程软骨修复关节软骨缺损是目前正在尝试的一种新方法，具有良好的发展潜力。关节软骨细胞是组织工程理想的种子细胞，但如何分离获取数量多、活性高、分化良好的软骨细胞是组织工程培养技术中的重要问题之一。近年来对生长因子在关节软骨形成和退变过程中的作用日益受到重视，并开展了广泛的研究，认为种子细胞需要适应生长因子的调控才能获得良好的生物活性。由于鹿茸生长的特殊性，故人们推测鹿茸中可能存在某种活性物质控制并刺激鹿茸生长。鹿茸多肽（PAP）是从梅花鹿茸中提取的一种多肽类生物活性因子，为鹿茸的主要活性成份。因此，本研究采用体外培养大鼠软骨细胞的方法，观察PAP对其增殖的影响，为优化组织工程的种子细胞提供一定的理论和实验依据。
1 材料
1.1 实验动物 SD大鼠（闽验证字20050001，合格证号2005C03），清洁级，福建医科大学实验动物中心提供，3～4周龄，体重180～200g，皆为雄性，共8只。
1.2 主要试剂 αMEM培养基(Gibco公司)、胎牛血清（FBS，HyClone公司）；胰蛋白酶1∶250(Trypsin，Amersco公司)、Ⅱ型胶原酶(Sigma公司)、PBS(Gibco公司)；噻唑蓝（MTT，上海申能博采公司），二甲基亚砜(DMSO，Amersco公司)；增殖细胞核抗原PCNA(美国NeoMarkers公司)；PAP粉针由长春中医学院赵文海教授惠赠。
2 方法
2.1 大鼠软骨细胞的获取、鉴定与药物干预分组情况 取4周龄体重180～200g的SD大鼠，断颈处死，参考Hu等［1］软骨细胞分离培养方法进行实验，获取软骨细胞置于5%CO2混和气体环境、37℃恒温箱内单层培养，隔3日首次换液，8～10 天达85%融合后进行传代培养。以传代次数（passage，P）分组，P0即原代细胞，P1即第1次传代后细胞，P2即第2次传代培养细胞，余类推。软骨细胞鉴定采用阿力新蓝染色法检测GAG合成、免疫组化法及RT－PCR法检测Ⅱ型胶原表达［2］。实验分组为P2组、P3组、P4组及鹿茸多肽不同剂量组（低、中、高不同药物浓度干预后的P4软骨细胞组），鹿茸多肽干预组分组的方法采用传代分组法：倒置相差显微镜下进行观察，当P3代软骨细胞融合达到85%时，进行传代（1传3），以胰酶消化贴壁细胞，反复吹打，使细胞均匀悬浮，离心（1 500rpm，5分钟），洗涤2次；对αMEM（含5%FBS）进行加药，分别配制含不同浓度的PAP培养基，分别加药使各瓶培养基药物终浓度为PAP 5μg/mL、PAP 10μg/mL、PAP 15μg/mL；分别以上述不同含药浓度培养基吹打混匀各瓶P3细胞，进行传代，使药物干预组软骨细胞进入P4代。按实验要求调整细胞浓度，分别接种软骨细胞于底面积25cm2培养瓶（细胞浓度5×105/mL）、6孔培养板（置入盖玻片）（细胞浓度5×105/mL）、96孔培养板（细胞浓度4×105/mL）， 于37℃、5%CO2饱和湿度孵育箱中孵育，其中PAP分组参考剂量来源于前期实验［3］。
2.2 各代软骨细胞MTT比色试验 将不同代次大鼠软骨细胞以5×104/mL浓度接种于96孔培养板中，常规培养24小时后用含体积分数为5%FBS的αMEM培养，并分别加入PAP，使PAP终浓度为5、10、15μg/mL，加药后分别继续培养48小时 ，加入MTT溶液呈色。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各个孔光吸收值。
2.3 各代软骨细胞周期分析及增殖指数检测 将培养的待测各代软骨细胞分别置5mL试管中，用PBS或生理盐水洗2次，制成单细胞悬液，无水乙醇固定细胞，加入PBS调整细胞浓度为5×105～5×106个细胞加入1mL DNA荧光染料（PI），室温下避光染色15分钟，以流式细胞仪(Becton Dickinson FACScan，美国)分析各代软骨细胞周期及检测增殖指数。
2.4 各代软骨细胞免疫细胞化法检测各组软骨细胞PCNA表达 将不同代次软骨细胞接种于6孔板，孔内均预置一块盖玻片，常规培养48小时后取出盖玻片，用免疫组织化学二步法检测PCNA表达情况，结果分析：采用HPIAS21000高清晰度图像处理系统进行图像分析，测定PCNA阳性信号的面积密度( Sv =PCNA阳性信号面积和/窗口面积×窗口数)。
2.5 统计学方法 以上检测均随机取多个样本，每个样本多次重复。应用SPSS11.0统计软件进行分析。进行Oneway ANOVA检验和Pearson相关分析，定量资料实验结果以均数±标准差表示，P
3 结果
3.1 各组软骨细胞MTT比色结果 MTT比色分析显示：随着软骨细胞传代培养，从P2代细胞至P4代软骨细胞在传代培养过程中细胞能量代谢呈下降趋势，逐代相比OD值有显著差异（P
图1 各组软骨细胞在不同观察时间点的增殖情况(OD值)（略）
3.2 各组软骨细胞细胞增殖指数结果 流式细胞术实验结果显示：随着软骨细胞传代培养，从P2代细胞至P4代细胞，细胞增殖指数呈下降趋势，分别为20.9%、16.8%、12.6%，PAP干预后的P4各组细胞增殖指数高于P4细胞，分别为19.7%、21.4%、19.4%，其中PAP 10μg/mL组促进软骨细胞增殖的作用最高，见图2。
图2 各组软骨细胞细胞周期PI值（略）
3.3 各组软骨细胞PCNA检测结果 免疫细胞化学法检测各组软骨细胞PCNA表达显示：随着软骨细胞传代培养，从P2代细胞至P4代软骨细胞在传代培养过程中的阳性表达呈下降趋势，逐代相比其阳性表达有显著差异（P
图3 各组软骨细胞PCNA表达（略）
A：P2(×400)，B：P3(×400)，C：P4(×600)，D：PAP 10μg/mL(×400)
图4 各组软骨细胞PCNA阳性表达面积密度比值（略）
4 讨论
鹿茸具有很强的壮肾阳、益精血、强筋骨的作用，是重要的滋补强壮中药。从药理上分析，鹿茸内含有丰富的多糖类、氨基酸类、脂肪酸类物质以及多种生长因子及其它营养成分，可以为软骨细胞的生长提供充足的营养条件。鹿茸是一种特殊的骨组织，在春季生发季节以1～2cm/d的速度生长，故推测鹿茸中可能存在生长因子促进骨质和表皮层的增殖。目前王本祥研究室应用凝胶过滤和离子交换层析等技术，从梅花鹿茸中分离纯化出一种多肽，经高效液相色谱和N-末端氨基酸分析鉴定为单一多肽，氨基酸组成分析证明，PAP是由68个氨基酸残基组成，分子量为7 200［4］。此多肽主要含有缬氨酸、丙氨酸、赖氨酸和甘氨酸，没有半胱氨酸。实验证明PAP具有很强的促进骨、软骨细胞增殖的作用［5-6］。实验所见软骨细胞在体外传代培养过程中细胞增殖能力呈下降趋势，本实验从MTT比色分析细胞能量代谢，流式细胞术考察其增殖期细胞含量，免疫细胞化学法检测增殖细胞核抗原表达等方面看到从P2代细胞至P4代细胞，软骨细胞增殖能力明显下降，如何以生长因子刺激促进软骨细胞的增殖能力对于将软骨细胞作为种子细胞用于软骨组织工程具有积极意义。生长因子对靶细胞的调控与其剂量密切相关，因此，确定能产生最佳调控软骨细胞增殖的PAP剂量至关重要。本文在预实验的基础上用MTT比色试验所筛选的不同剂量的PAP能不同程度地促进软骨细胞的能量代谢。说明PAP能促进软骨细胞增殖，而且以10μg/mL浓度为最佳。PCNA是一种仅在增殖细胞中合成或表达的核内多肽，其表达和合成与细胞周期有关。主要表达增殖细胞的S期、G1期、G2初期，因此成为检测细胞增殖活性最为有效的标志之一。本实验免疫组化结果证实，PAP以10μg/mL浓度时软骨细胞表达致密的棕褐色颗粒最多，其他组则较少，说明PAP可通过促进PCNA表达来调控DNA复制。细胞周期与细胞中DNA含量密切相关，DNA含量随着细胞周期各期而发生变化。当细胞受到某些因素刺激时，可使DNA含量发生变化，从而引起细胞周期发生改变。细胞增殖指数是S期与G2期DNA含量之和与S期、G2及G1期DNA含量之和的比，它是反映细胞增殖的重要指标之一。本实验FCM结果显示，PAP能显著提高软骨细胞增殖指数，且以10μg/mL浓度时最明显。综上所述，PAP不仅具有显著的生物活性，可以促进软骨细胞的增殖，而且还能阻止软骨细胞在连续体外培养过程中的增殖衰老趋势，本实验可以为优化组织工程中的种子细胞提供一定理论和实验依据，有关PAP抗软骨细胞传代老化的实验有待进一步探讨。
参考文献
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摘要：目的：选取合适的培养条件，促进兔纤维环间充质干细胞的增殖，维持其干细胞的特性。方法：从兔纤维环中提取间充质干细胞，进行体外培养扩增。考察丙酮酸钠对干细胞集落形成能力、增殖能力、细胞形貌和分化能力的影响。结果：丙酮酸钠明显增加兔间充质干细胞的集落形成的数目；促进细胞增殖；维持干细胞的干细胞特性；同时不影响干细胞的成脂成脂分化，反而抑制细胞的自发分化。结论：丙酮酸钠可较好地促进体外干细胞增殖和干细胞特性，使在体外快速获得大量良好状态的干细胞。
关键词：干细胞培养 丙酮酸钠 细胞增殖 细胞分化
1.引言
间充质干细胞具有多向分化特性，来源广泛，可从多种组织中提取。近期一系列研究表明，在正常及轻度退变椎间盘的纤维环中都存在具有多向分化特性的细胞，能在体外培养条件下被诱导分化为脂肪细胞、软骨细胞和成骨细胞，具有间充质干细胞的特征，但这些细胞的增殖能力有限1-3。
本研究从兔纤维环组织中分离出具有自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，通过改变细胞培养条件，考察其增殖能力和多向分化潜力，以期获取大量具有良好状态的干细胞。
2.材料与方法
2.1 药品与试剂
5～7月龄的新西兰大白兔由苏州大学南校区动物房获得。
DMEM-LG培养基、胎牛血清FBS、青-链霉素，购自Hyclone公司。
胰酶，购自Gibco公司。
成脂诱导培养基、成骨诱导培养基购自cyagen公司，茜素红、油红O购自Sigma-Aldrich公司。
2.2 兔纤维环间充质干细胞提取
空气栓塞法处死新西兰大白兔后，在无菌状态下快速获取椎间盘组织并将纤维环组织分离出。将组织剪碎，以I型胶原酶消化、过滤。过滤后的细胞液体离心计数后接种于培养瓶中，分别加入2种培养基进行培养。其中一种培养基为含10% FBS的DMEM-LG细胞培养液，另一种为含10% FBS和200 ug/mL丙酮酸钠的DMEM-LG细胞培养液，于37℃、5％的CO2培养箱中培养。每3天换1次液。
2.3 细胞增殖检测
将细胞按1000细胞/孔的密度接种于96孔板中，分别以无丙酮酸钠和含丙酮酸钠的DMEM-LG培养基连续9天检测细胞的增殖情况，每天6个复孔。进行MTT检测。
2.4 诱导分化检测
将两种条件下培养的细胞分别按2×104细胞/孔的密度将细胞接种于24孔板中，待细胞长到80-90%时，进行成脂分化和成骨分化。成脂诱导2周后进行油红染色。成骨诱导3周后茜素红进行染色。
3.结果
3.1 丙酮酸钠促进兔间充质干细胞集落形成
细胞悬液按一定密度接种到100 mm培养皿中后，到第3-4天即可观察到集落的产生，集落逐渐增大，到10天左右即可形成大量集落。对比有丙酮酸钠和没丙酮酸钠的培养基可发现，在相同接种密度的条件下，丙酮酸钠组形成的集落数更多，集落中的细胞数也更多。
3.2 丙酮酸钠促进兔间充质干细胞增殖
MTT增殖检测发现，细胞从第1天开始增殖，第3天开始进入对数期，第6天以较为缓慢的速度继续增殖直至第9天。对比无丙酮酸钠组和丙酮酸钠组，相同条件下，丙酮酸钠组的细胞数明显更多。
3.3 丙酮酸钠维持兔间充质干细胞的状态
在细胞形貌上，无丙酮酸钠组细胞呈现异质性，有些呈梭形，有些呈纤维细胞状；而丙酮酸钠组的细胞则相对较为均匀，均呈现梭形。在传代次数上，无丙酮酸钠组的细胞只能传3-4代，细胞即停止增殖，由原来的梭形以及纤维细胞状转变为扁平无规状细胞。而丙酮酸钠组的细胞则至少可传代到6代以上，同时细胞也仍旧保持梭形的形貌。
3.4 丙酮酸钠抑制兔间充质干细胞的自发分化
将无丙酮酸钠组细胞和非丙酮酸钠组细胞接种到24孔板中，分别进行成脂诱导和成骨诱导。在诱导组分别使用诱导培养基，对照组使用含10% FBS的DMEM-LG培养基。但是在无丙酮酸钠组，对照组的细胞易自发成脂的现象。在培养1周后即自发产生脂滴，随着培养时间的延长，脂滴逐渐增大。油红染色后，亦有明显的染色现象。但是丙酮酸钠组的细胞则自发成脂的现象明显减轻。自发成骨的现象也更弱些。
4.讨论
本研究从兔子的纤维环组织中成功分离出一群具有克隆形成能力的细胞，该细胞较好地维持了原有形态。通过在DMEM-LG培养基中添加丙酮酸钠，发现丙酮酸钠可明显促进兔间充质干细胞的集落形成及增殖速度。此外，丙酮酸钠可维持干细胞的干细胞特性，维持较为均一的梭形形态，可传代6次以上。同时不影响干细胞的成脂成脂分化，反而抑制细胞的自发分化，在组织工程中将有良好的应用前景。
参考文献：
[1]Feng， G.， et al. Multipotential differentiation of human anulus fibrosus cells：an in vitro study. J Bone Joint Surg Am 92， 675-685 （2010）.
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