【关键词】 反义 寡核苷酸 乳腺癌 HER2 mRNA 紫杉醇
0 引言
乳腺癌的化学治疗近年来有了长足的进展，然而，经多线治疗仍复发转移的晚期患者的治疗，仍然十分棘手。探索包括生物靶向治疗在内的新疗法已成为近年研究的热点之一。
本研究室的前期研究表明，以HER2 mRNA为靶点的特异性硫代反义寡核苷酸，可以抑制HER2过表达乳腺癌细胞株增殖活性[1]。本研究拟对既往合成的反义寡核苷酸HA6722 单用或与紫杉醇联用时的抗乳腺癌活性进行研究，试图探索乳腺癌治疗新方法。
1 材料与方法
1.1 细胞系及培养
本研究采用的细胞株有：MDAMB453（HER2过表达），细胞培养所需的培养基为L15（Gibco， BRL），内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone），置37℃、不含CO2的培养箱中培养；MDAMB231（HER2低表达）的体外培养采用RPMI1640（Gibco， BRL）培养基，内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone），置37℃、含体积分数为5%的CO2培养箱中培养传代。当细胞生长至80%～85%融合时用0.25%胰蛋白酶消化，传代和收集细胞。
1.2 硫代反义寡核苷酸的合成及体外脂质体转染
反义寡核苷酸的靶向HER2 mRNA反义寡核苷酸HA6722序列为含20个核苷酸的寡聚核苷酸，其命名原则及合成见文献报道[2]。全程硫代修饰，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。序列如下：HA6722：5′CAG CAG CCG AGC CAG CCC GA3′
琼脂糖凝胶电泳结果表明反义寡核苷酸纯度符合要求。反义寡核苷酸以无血清无抗生素的L15或RPMI1640培养基溶解浓度为50μmol·L-1的溶液，过滤除菌，-20℃储存，临用时稀释至所需浓度。
反义寡核苷酸体外脂质体转染按Invitrogen， Gibco BRL公司脂质体转染说明书所述方法进行。当培养细胞达到65%～70%融合时，进行转染，具体方法见文献[3]。
1.3 紫杉醇 由海南海药公司提供，30mg/支，临用时以无菌生理盐水稀释成所需浓度。
1.4 噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium， MTT）法检测细胞活度 取对数生长期的上述细胞，以不同数量接种96孔培养板（Costar，USA），接种数量分别为：MDAMB453 5×104/孔、 MDAMB231 2×104孔。实验组及对照组细胞培养均设三个平行孔。待细胞生长至65%～70%融合时，用脂质体2 000将不同浓度的HA6722转染细胞4～6h，再加入同摩尔浓度的紫杉醇，随后继续培养24～72h，倾去培养液，加新鲜配置的MTT溶液（0.5mg/ml）200μl，继续孵育4h，吸去MTT溶液，每孔加200μl DMSO， 轻轻震荡20～30min，酶联仪测定光吸收值（OD值）。
1.5 细胞凋亡（apoptosis）检测 凋亡试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。以100nmol·L-1的HA6722及紫杉醇分别单独处理MDAMB453细胞12h，以及用50nmol·L-1的HA6722和相同浓度的紫杉醇先后作用MDAMB453乳腺癌细胞6h，收集经紫杉醇及HA6722单药或联合作用后的MDAMB453乳腺癌细胞，离心涂片，按操作说明检测细胞凋亡。细胞核内出现棕褐色沉淀为阳性，反之为阴性。凋亡指数（AI）=（凋亡细胞数/计数总细胞数）×100%。
1.6 反义药物及紫杉醇的疗效评价
对数生长期的MDAMB453细胞及MDAMB231细胞经系列浓度的HA6722及紫杉醇单用或联合作用后， MTT法测定OD值。紫杉醇单用时的系列终浓度为1、4、16、64、250及1 000nmol·L-1，而HA6722单用时的系列终浓度为12.8，32，80，200，500，1 250nmol·L-1；联合应用时二者以等摩尔浓度混合，系列浓度依次为6.4、16、40、100、250及625nmol·L-1，反应终体积为200μl。生存分数f按下述公式计算：f=ODtreat/ODcontrol(1)
联合方案的疗效评价按有关文献进行[4，5]，即以log(1/f1)对log（药物浓度）作图，并行线性拟合，得曲线的x轴截距即为log（IC50），和直线斜率m，利用下述公式计算产生效应f时的单药及联合时的药物浓度：Dosef=DoseIC50[(1/f)1]1/m (2)
由于联合方案采用的是固定摩尔浓度比，因此产生效应f的药物浓度可分解为联合药物的浓度（D）1和（D）2，对于产生任一效应f时的药物联合指数(combine index，CI)可以下列公式算出：
CI＝（D）1（Df）1＋（D）2（Df）2＋α（D）1（D）2（Df）1（Df）2(3)
式中（D）1和（D）2分别代表联合用药产生效应f时的浓度，而（Df）1和（Df）2分别代表药物单用时产生效应f时的浓度；根据推测两药不排斥或相互排斥的可能，α取值1或0；CI反映二药联合的相互作用，大于1表示拮抗，等于1表示相加，小于1表示协同。全部试验均进行3次以上重复。
1.7 统计学处理
采用SPSS10.0统计分析软件进行统计学处理，实验数据以±s表示，均数比较采用Student’s t检验和方差分析F检验（One Way Anova）。
2 结果
2.1 HA6722及紫杉醇单用时对两种乳腺癌细胞的抑制作用
在1、4、16、64、250及1 000nmol·L-1的终浓度下，紫杉醇对两种乳腺癌细胞的生长均显示剂量依赖性抑制作用，其抑制的IC50值分别为19.4±4.1nmol·L-1及23.6±5.7nmol·L-1，见图1A；而在12.8、32、80、200、500、1 250nmol·L-1的系列浓度作用下，HA6722对两种不同HER2表达水平的乳腺癌细胞的体外生长的影响迥然不同，对HER2过表达的MDAMB453细胞呈现明显的剂量依赖性抑制，而对HER2低表达的MDAMB231细胞则几乎没有抑制， IC50分别为47.6±7.9nmol·L-1和731.8±14.3nmol·L-1(n=3，P＜0.01，见图1B。
2.2 HA6722及紫杉醇乳剂合用对MDAMB453乳腺癌细胞的抑制作用
从上述初步结果可以看到，12.8nmol·L-1浓度的HA6722对MDAMB453细胞的抑制率只有4.7%，因而该浓度被作为非治疗浓度用于增强紫杉醇的药理作用研究，结果表明，由于该浓度HA6722的加入，紫杉醇对MDAMB453细胞的抑制作用增强，IC50值由19.4±4.1nmol·L-1降至13.6±5.2nmol·L-1（n= 3，P＜0.05）。
等摩尔浓度的HA6722与紫杉醇合用的研究表明，经6.4、16、40、100、250及625nmol·L-1的两种药物共同作用，MDAMB453细胞增殖呈现更为明显的抑制，见图2 A、B、C。在IC50浓度下的联合指数CI为0.85±0.16(n=3)，在研究涉及的全部药物浓度范围内，两种药物的联合指数波动在（0.85±0.11）～（0.87±0.27）之间，见图2D。
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为了澄清HA6722与紫杉醇协同抗肿瘤作用是否具有细胞选择性，对HER2低表达的乳腺癌细胞株MDAMB231细胞也进行了同样的研究，结果表明，等摩尔浓度的二种药物合用对该细胞株的联合指数在所检测的药物浓度下，波动在（1.13±0.21）～（1.19±0.24）之间，见图3。
2.3 HA6722及紫杉醇乳剂合用对MDAMB453乳腺癌细胞凋亡的影响
经100nmol·L-1的HA6722及紫杉醇分别单独处理或以50nmol·L-1的HA6722和相同浓度的紫杉醇先后作用MDAMB453细胞后，TUNEL法对细胞凋亡的检测显示，HA6722与紫杉醇合用增强了细胞的凋亡作用（n=3，P＜0.05），见表1。
3 讨论
业已证明，原癌基因HER2过表达是一个独立的、不良的预后指标，将导致乳腺癌患者对某些化疗方案耐药[6]，生存期缩短[7]。
图1 紫杉醇及反义寡核苷酸HA6722单用时对两种乳腺癌细胞株，MDAMB453及MDAMB231细胞体外增殖的影响（略）
图3 等摩尔浓度的HA6722与紫杉醇合用时对MDAMB231联合指数随生存分数的变化曲线（略）
图2 紫杉醇和HA6722单用或联合时对MDAMB453细胞增殖的影响（略）
表1 HA6722与紫杉醇单用或联合应用对MDAMB453细胞凋亡的影响（略）
MDAMB453组*P
紫杉醇是一种新型的抗微管集聚剂，是当前乳腺癌治疗中疗效较高的药物之一。然而，由于绝大部分细胞毒药物存在剂量限制性毒副作用（DLTs），因而单用化疗药物不但无法治愈肿瘤，而且还会产生严重的毒副作用。事实上，一度被认为乳腺癌根治希望所在的大剂量化疗（HDCT）加干细胞支持疗法也并没有达到根治甚至是有效改善乳腺癌患者预后的目的[8]。
生物靶向治疗近年逐渐成为研究的焦点，以bcl2等基因为靶点的反义药物G3139已在体外及体内研究中均显示出明确的抗肿瘤作用，并可增强细胞毒药物的抗肿瘤效果[9，10]。如采用反义药物与细胞毒药物联合的办法，能在不影响抗肿瘤效果的前提下，降低细胞毒药物的用量，减少或避免毒性反应的发生，不失为一种两全的策略。本研究对反义药物HA6722与细胞毒药物紫杉醇对乳腺癌细胞体外增殖进行了相关研究。结果表明， 以低剂量（非治疗剂量）的HA6722与紫杉醇联合，可以引起紫杉醇抗MDAMB453细胞增殖活性的明显增强，IC50值由19.4±4.1nmol·L-1降至13.6±5.2nmol·L-1（n=3，P＜0.05）；而等摩尔浓度的上述两种药物联合，其对MDAMB453细胞的抗增殖作用较之两倍浓度的单药作用更强。在IC50浓度下两药的联合指数CI为0.85±0.16(n=3)，表明二者合用对HER2过表达的MDAMB453细胞的抑制作用是协同的。
本研究对两种药物合用时对乳腺癌细胞的凋亡过程进行了观察。结果表明，合用时MDAMB453细胞凋亡率明显强于二药之一的单独应用，与文献报告一致[11，12]。
本研究尚对另外一种HER2正常表达细胞MDAMB231细胞进行了研究，结果表明，HA6722和紫杉醇合用并未引起抗肿瘤活性的增强，进一步说明，这两种药物的协同抗肿瘤作用，是以乳腺癌细胞的HER2基因乃至受体过表达为前提，其详细机制有待于进一步研究。
【参考文献】
［1］ 杨栓平，宋海峰，宋三泰，等. 靶向HER2 mRNA反义寡核苷酸对SKBR3乳腺癌细胞Caspase3蛋白表达的影响［J］. 中国药理学通报， 2003， 19（5）：505507.
[2] Yang SP， Song ST， Tang ZM， et al. Optimization of antisense drug design against conservative local motif in simulant secondary structures of HER2 mRNA and QSAR analysis［J］. Acta Pharmacol Sin， 2003， 24(9): 897902.
[3] 孙君重， 宋海峰， 宋三泰， 等. 靶向HER2 mRNA反义硫代寡核苷酸体外抗乳腺癌活性研究［J］. 肿瘤防治研究， 2005， 32（12）：745748.
[4] Quantitative analysis of doseeffect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors［J］. Adv Enzyme Regul， 1984， 22: 2755.
[5] Xu JM， Azzariti A， Severino M， et al. Characterization of sequencedependent synergy between ZD1839 (“Iressa”) and oxaliplatin［J］. Biochem Pharmacol， 2003， 66(4): 551563.
[6] Del Mastro L， Bruzzi P， Nicolo G， et al. HER2 expression and efficacy of dosedense anthracyclinecontaining adjuvant chemotherapy in breast cancer patients［J］. Br J Cancer， 2005， 93(1): 714.
[7] Ross JS， Fletcher JA. The HER2/neu oncogene: prognostic factor， predictive factor and target for therapy［J］. Semin Cancer Biol， 1999， 9(2): 125138.
[8] 孙君重，江泽飞，宋三泰. 对乳腺癌高剂量化疗的再认识［J］. 国外医学肿瘤学分册， 2003， 30（2）：119122.
[9] Rudin CM， Kozloff M， Hoffman PC， et al. Phase I study of G3139， a bcl2 antisense oligonucleotide， combined with carboplatin and etoposide in patients with smallcell lung cancer［J］. J Clin Oncol， 2004， 22(6): 11101117.
[10]Rait AS， Pirollo KF， Xiang L， et al. Tumortargeting， systemically delivered antisense HER2 chemosensitizes human breast cancer xenografts irrespective of HER2 levels［J］. Mol Med， 2002， 8(8): 475486.
【摘要】目的：采用Survivin反义寡核苷酸(ASODN)复合物抑制survivin的表达，研究其对槲皮素诱导肝癌SSMC7721细胞凋亡的影响.方法：体外培养人肝癌SSMC7721细胞，取对数生长期细胞进行实验.实验分Ⅰ,Ⅱ两部分：Ⅰ分为空白对照组(设平行组)、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、400μmol/LSODN复合物组、400μmol/LASODN复合物组(设平行组)，转染48h;Ⅱ弃掉Ⅰ部分各组培养液，换新指定培养液，分为空白对照组、40μmol/L槲皮素组、脂质体LipofectamineTM2000组、SODN复合物组、ASODN复合物组、ASODN复合物+40μmol/L槲皮素组(联合组)，孵育细胞24h后检测.Ⅰ结束时采用RTPCR、细胞免疫组化染色检测各组SSMC7721细胞survivin表达变化；Ⅱ结束时用吖啶橙染色法观察细胞凋亡时形态变化，MTT法检测SSMC7721细胞生长抑制率，AnnexiV/PI双染流式细胞仪检测SSMC7721细胞凋亡率.结果：ASODN复合物作用肝癌SSMC7721细胞48h后能下调survivinmRNA及Survivin蛋白的表达(P<0.01)；与其他组比较，联合组AO染色图片可观察到凋亡小体等典型的细胞凋亡形态特征变化且凋亡细胞数量明显增多，并用MTT法、AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测显示联合组细胞的生长抑制率增高(P<0.01)、细胞凋亡率提高(P<0.01).结论:ASODN复合物可有效抑制肝癌SSMC7721细胞survivin基因的表达；ASODN复合物能增强槲皮素对SSMC7721细胞增殖抑制及诱导凋亡的作用即二者具有协同作用，该作用可能与抑制survivin基因的表达有关.
【关键词】反义寡核苷酸；槲皮素；肝肿瘤；细胞凋亡；细胞周期；Survivin
0引言
肝癌(hepaticcarcinoma,HCC)是世界范围内发病率较高的恶性肿瘤之一，对于大多数肝癌患者，经肝动脉化学药物栓塞治疗和全身化疗仍是最常用的治疗方法.近年来抗凋亡机制在肿瘤细胞耐药性发生中的作用倍受关注［1］.survivin是1997年由Ambrosini等［2］发现，Ito等［3］报道Survivin蛋白对破坏肝癌细胞增生凋亡平衡、促进肝癌细胞快速增生具有重要作用.槲皮素(quercetin,Quc)是广泛分布于蔬菜、水果、中草药等的一种天然的黄酮类化合物，化学名为3,3′,4′,5,7五羟基黄酮.LopezLazaro等［4］研究表明，Quc没有毒副作用.近年来的研究表明Quc在体外、动物实验模型中均显示出抗癌活性［4-6］.本实验旨在研究反义抑制survivin的表达，检测其对Quc抑制肝癌SSMC7721生长和诱导细胞凋亡的影响，探讨反义抑制survivin的表达是否在体外可增强Quc抗癌作用及可能的机制，为其进一步动物实验和临床应用提供新的实验依据.
1材料和方法
1.1材料人肝癌细胞株SSMC7721兰州大学医学实验中心提供.RPMI1640(Sigma公司)，小牛血清(杭州四季清公司)，槲皮素(Sigma公司,用前以少量DMSO溶解，用时加RPMI1640稀释至使用浓度)，MTT(Sigma公司),Trizol(BBI公司)，Survivin蛋白一抗兔抗人抗体、二抗羊抗兔抗体(北京中山公司)，TaKaRa试剂盒(宝生物工程公司)，AnnexiV/PI试剂盒(宝灵试剂公司),阳离子脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen公司).寡核苷酸(ODNs)脂质体(Lip)转染复合物survivin正、反义寡核苷酸的设计、合成：根据survivin的基因序列(GenBankAccessionNumberU75285),应用Primer5.0软件设计互补于survivinmRNA的232-251序列的20个碱基组成的ASODN链：5′CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG3′,同时合成正义链：5′CGCAGTAGCTGCGCTGATTG3′,两条链均采用硫代磷酸化修饰.在GenBank中证实反义寡核苷酸(ASODN)及正义寡核苷酸(SODN)与任何已知哺乳动物基因无匹配，上海生工公司合成.用LipofectamineTM2000输送ODNs，依文献［7］ODNs/LipoTM2000=4g/L配置ODNsLipoTM2000转染复合物，按质脂体转染试剂盒说明书进行操作.
1.2方法取对数生长期的SSMC7721细胞，消化、收集、计数并接种于96孔或6孔培养板或100mL细胞培养瓶.
1.2.1分组实验分Ⅰ,Ⅱ两部分：Ⅰ分为空白对照组(设平行组)、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、400μmol/LSODN复合物组、400μmol/LASODN复合物组(设平行组)，转染48h;Ⅱ弃掉Ⅰ部分培养液，换新指定培养液，分为空白对照组、40μmol/L槲皮素组、脂质体LipofectamineTM2000组、SODN复合物组、ASODN复合物组、ASODN复合物+40μmol/L槲皮素组，孵育细胞24h后检测.
1.2.2RTPCR检测SSMC7721细胞survivinmRNA表达变化在实验Ⅰ部分结束时，按Takara试剂盒操作说明书进行，收集各组细胞，Trizol提取总RNA,用紫外分光光度计检验纯度并定量.设βactin为内参照，对样品模板用量标准化,survivin和βactin分管扩增,引物由上海生工公司合成.其序列如下：survivin引物序列5′AAAGAGCCAAGAACAAAATTGC3′(F)和5′GAGAGAGAAGCAGCCACTGTTAC3′(R),338bp;βactin引物序列5′CTTCTACAATGAGCTGCGTG
3′(F)和5′TCATGAGGTAGTCAGTCAGG3′(R),243bp.10μL逆转录体系用于逆转录合成cDNA,30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min完成逆转录.10μLcDNA用于PCR反应,分别单独加入相应上下游引物等在50μLPCR反应体系进行PCR反应.94℃预变性2min后进入PCR循环，条件：survivin和βactin，94℃变性30s,54℃复性30s,72℃延伸30s,共35个循环；RTPCR产物8μL在18g/L琼脂糖凝胶上电泳，经凝胶图像分析仪分析结果，以survivin与βactin的比值作为survivinmRNA表达的相对含量.
1.2.3细胞免疫组化染色检测SSMC7721细胞Survivin蛋白表达变化取对数生长期细胞于预先置入盖玻片6孔板进行细胞爬片，在实验Ⅰ部分处理结束时，取出各组爬片细胞，PBS液轻轻漂洗，750mL/L乙醇固定，按试剂盒操作步骤进行细胞免疫染色.以正常鼠血清和磷酸盐缓冲液分别代替一抗行替代对照和空白对照.于普通光学显微镜下观察，以细胞核或细胞质出现棕褐色或棕黄色颗粒为阳性，随机选取5个高倍视野进行计数，每个高倍视野计数100个细胞，共500个细胞，计算细胞Survivin蛋白阳性表达率.
1.2.4吖啶橙(AO)染色法观察细胞凋亡时形态变化消化、收集实验Ⅰ,Ⅱ两部分处理的各组细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2遍，制成单细胞悬液，浓度1010个/L,750mL/L乙醇固定4h,离心弃乙醇，加入8.5mg/L的AO2mL工作液，室温染10min后，滴几滴在载玻片，加缓冲甘油封片.在荧光显微镜下用吸收波长405nm,发射波长550~630nm观察，并随机拍照.
1.2.5MTT法检测细胞增殖变化取对数生长期的SSMC7721细胞，消化、收集、计数并接种于96孔板，每孔2×103个，并设3个复孔.实验设数个平行板，分Ⅰ,Ⅱ两部分；到实验预定点前4h加5g/L的MTT10μL，37℃反应4h，弃掉MTT，加200μLDMSO,轻轻振荡10min,使结晶溶解，酶标仪检测570nm波长A值.计算细胞生长抑制率(inhibitoryrate，IR).重复2次，取平均值.IR(%)=(A对照组-A实验组)/A对照组×100%.
1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡率消化、收集经实验Ⅰ,Ⅱ两部分各处理组细胞，按AnnexinV细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，加入Bindingbuffer缓冲液200μL、AnnexinV/FITC(20mg/L)10μL和PI液(50mg/L)5μL，室温避光孵育30min后加入Bindingbuffer缓冲液300μL，立即用流式细胞仪FACScan(BeclonDickison公司)测定，经计算机软件处理，计算凋亡细胞百分率,实验重复2遍.
统计学处理:实验数据以x±s表示；应用SPSS13.0统计软件进行分析，采用单因素方差分析，并进行两两比较(q检验).以P<0.05认为差异有统计学意义.
2结果
2.1ASODN反义复合物对肝癌SSMC772细胞survivinmRNA表达的影响RTPCR检测survivinmRNA水平显示400nmol/LASODN反义复合物组(0.21±0.03)较空白对照组(0.99±0.02)、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组(0.94±0.03),400nmol/LSODN复合物组(0.94±0.03)RTPCR扩增的条带减弱(P<0.01).通过计算机图像分析结果表明，400nmol/LASODN反义复合物组与空白对照组、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、400nmol/LSODN复合物组相比较差异有统计学意义(P<0.01)，其他各组间相比较差异无统计学意义.
2.2ASODN反义复合物对肝癌SSMC772细胞Survivin蛋白表达的影响细胞免疫组化染色结果显示，400nmol/LASODN反义复合物组(19.7±3.7)%较空白对照组(76.5±8.7)%、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组(74.5±8.2)%,400nmol/LSODN复合物组(73.9±7.9)%Survivin蛋白表达明显下调，差异有统计学意义(P<0.01).
2.3细胞凋亡形态学变化ASODN反义复合物联合槲皮素组凋亡细胞数量明显较空白对照组、等量脂质体LipofectamineTM2000对照组、SODN复合物组、ASODN复合物组及槲皮素组增加，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质成红色荧光.凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体等典型改变(图1).
2.4MTT法检测SSMC7721细胞增殖变化ASODN复合物组（28.4%）或槲皮素组（43.1%）可抑SSMC7721细胞增殖(P<0.01)，而脂质体组（1.7%）则无此效，ASODN反义复合物联合槲皮素时表现出协同抑制细胞增殖作用（69.8%），两药联合对细胞的增殖抑制效果高于单用ASODN复合物组（28.4%，P<0.01)和槲皮素组(43.1%，P<0.01).
2.5细胞凋亡率的变化与空白对照组、脂质体对照组相比，ASODN复合物组、槲皮素组、ASODN复合物+槲皮素组均能诱导细胞凋亡，且其诱导细胞凋亡率(Annevix(+)PI(-))分别是脂质体组的3.1倍、4.3倍、18.2倍，差异有统计学意义(P<0.01)，ASODN复合物联合槲皮素组与ASODN复合物组、槲皮素组比较，其诱导细胞凋亡率分别是他们的5.9倍、4.2倍，差异有统计学意义(P<0.01)，并且各组间流式细胞仪检测时损伤率(Annexin(+)PI(+))无统计学意义（表1）.表1各组细胞凋亡率变化
3讨论
Survivin的组织分布特征具有明显的选择性，其表达于胚胎和发育
的胎儿组织，但不见于终末分化的成人组织(胸腺、生殖腺除外)，而表达于大多数肿瘤组织中［8-9］，使它成为一个癌的分子标志和治疗靶点.研究发现，Survivin能够通过杆状病毒IAP重复序列(BIR)作用于Caspase3,Caspase7来抑制凋亡蛋白酶活性，阻止多种凋亡信号诱导的细胞凋亡，而且能在细胞有丝分裂前期通过与纺锤体微管发生特异性结合反应，使肿瘤细胞逃避细胞周期G2/M期检测点的监控，抵抗因DNA损伤或突变自身诱导的细胞凋亡，从而导致肿瘤细胞异常分裂增殖［10］，另外Survivin蛋白亦可通过p21蛋白间接抑制caspase酶而起作用,阻断细胞的凋亡过程,其抑制细胞凋亡的作用远远大于bcl2家族成员,是迄今发现的最强的凋亡抑制因子.Survivin的高表达可以使肿瘤细胞免受各种凋亡信号的刺激而帮助细胞存活［11-12］.槲皮素(Quercetin)是具有多种生物活性的黄酮类化合物，其维生素P样的作用已应用于临床.国内外已有研究显示，槲皮素是目前已知的最强的抗癌剂之一，能够诱导多种肿瘤细胞凋亡［13］，同时槲皮素还有抗炎、抗过敏、抗氧化、降血脂、降压等生理活性.本实验应用反义核酸技术，用脂质体LipofectamineTM2000介导人工合成的特定DN段ASODN分子转染SSMC7721细胞，人工合成的特定DN段ASODN分子与进入细胞质的survivinmRNA上的特定位点相结合，形成DNARNA复合物，抑制survivinmRNA与核糖体结合，同时激活RNA降解酶H，降解survivinmRNA，从而抑制或封闭基因的表达，干扰survivin致病蛋白的产生［14］.实验结果显示，ASODN复合物作用于肝癌SSMC7721细胞48h后，采用RTPCR和细胞免疫组化检测示与空白对照组比较，ASODN复合物组survivinmRNA、Survivin蛋白表达明显下调，而等量脂质体组、SODN复合物组survivinmRNA、Survivin蛋白表达变化差异则无统计学意义，实验证明了ASODN复合物可有效抑制survivin基因的表达.实验进一步用等剂量的槲皮素(亚致死浓度)处理实验Ⅰ部分各实验组肝癌SSMC7721细胞24h后，实验结果显示，与其它组比较，ASODN复合物+40μmol/L槲皮素组(联合组)AO染色法观察在相同条件联合组满视野见典型细胞凋亡形态学变化且凋亡细胞数量明显增加，MTT法、AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测示在同等条件联合组细胞生长抑制率和细胞凋亡率明显高于其它组，差异有统计学意义.也就是有效封闭肝癌SSMC7721细胞survivin基因的表达能增强槲皮素对该细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用即ASODN反义复合物联合槲皮素对肝癌SSMC7721细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用具有协同效应.实验结果还表明，SSMC7721细胞survivin基因表达降低后，其抗凋亡能力被有效抑制了，推测联合组对肝癌细胞的协同细胞毒性导致的凋亡可能是通过两个凋亡途径的共同通路［15］即激活Caspase效应子而实现的.至于是通过死亡受体途径还是通过线立体途径介导的凋亡有待进一步研究.
【参考文献】
［1］HuangY,IbradoAM,ReedJC,etal.CoexpressionofseveralmolecularmechanismsofmultidrugresistanceandtheirsignificanceforpaclitaxelcytotoxicityinhumanAMLHL60cells［J］.Leukemia,1997,11(2):253-257.
［2］AmbrosiniG,AdidaC,AltieriDC,etal.Anovelantiapoptosisgenesurviving,expressedincancerandlymphoma［J］.NatMed,1997,3(8):927-921.
［3］ItoT,ShirakiK,YamanakaT,etal.Survivinpromotescellproliferationinhumanhepatocellularcarcinoma［J］.Hepatology,2000,31(5):1080-1085.
［4］LopezLazaroM.Flavonoidsasanticanceragents:Structureactivityrelationshipstudy［J］.CurrMedChemAnticancerAgents,2002,2(6):691-714.
［5］RanellettiFO,MaggianoN,SerraFG,etal.Quercetininhibitsp21RASexpressioninhumancoloncancercelllinesandinprimarycolorectaltumors［J］.IntJCancer,2000,85(3):438-445.
［6］ShiM,WangFS,WuZZ.SynergeticanticancereffectofcombinedquercetinandrecombinantadenoviralvectorexpressinghumanwildtypeP53,GMCSFandB71geneonhepatocellularcellsinvitro［J］.WorldGastroenterol,2003,9(1):73-78.
［7］DaiDJ,LuCD,LaiRY,etal.Survivinantisensecompoundinhibitsproliferationandpromotesapoptosisinlivercancercells［J］.WorldGastroenterol,2005,11(2):193-199.
［8］TongQS,ZhengLD,ChenFM,etal.Selectionofoptimalantisenseaccessiblesitesofsurvivinanditsapplicationintreatmentofgastriccancer［J］.WorldJGastroenterol,2005,11(5):634-640.
［9］AltieriDC.Survivin,versatilemodulationofcelldivisionandapoptosisinc
ancer［J］.Oncogene,2003,22(53):8581-8589.
［10］JohnsonAL,LangerJS,BridghamJT.Survivinasacellcyclerelatedandantiapoptosisproteiningranulosecells［J］.Endocrinology,2002,43(9):405-413.
［11］TammI,WangY,SausvilleE,etal.IAPfamilyproteinSurvivininhibitsCaspaseactivityandapoptosisinducedbyFas(CD95),Bax,Capase,andanticancerdrugs［J］.CancerRes,1998,58(23):5315-5320.
［12］ConwayEM,PollefeytS,SteinerMosonyiM,etal.DeficiencyofsurvivinintransgenicmiceexacerbatesFasinducedapoptosisviamitochondrialpathways［J］.Gastroenterology,2002,123(2):619-631.
［13］KimWK,BangMH,KimES,etal.QuercetindecreasestheexpressionofErbB2andErbB3proteinsinHT29humancoloncancercells［J］.JNutrBiochem,2005,16(3):155-162.
[关键词]关键词语 初中生物 概念教学
[中图分类号] G633.91[文献标识码] A[文章编号] 16746058（2016）140117
生物是一门特殊的学科，它有相当多的概念需要记忆和掌握，学生在学习时很难把握住概念的重点，在理解的时候有很多困难。而且生物对概念、名词、定律的知识要求精确到位，这样才能针对多种情况做出最准确的判断。因此，针对生物学科的这些特点，在进行生物概念教学时教师要引导学生把握关键词语，以此来提高生物概念教学的效率。
一、让学生在概念学习中学会把握关键词语
生物概念是影响概念形成的因素之一，复杂的概念有较多的自身特征，也有无关的特征，不容易分辨，学生记忆起来相当困难。根据科学实验表明，有关特征清晰的概念，学生记忆起来比较容易，而且概念的逻辑性和关联性越强，学生学习起来越容易。在进行生物概念教学时，如果无任何的知识准备，教师很难引导学生将新学的概念与已学的概念联系起来，所以，教师一定要在新旧概念之间搭建必要的“桥梁”，而这种桥梁就是生物概念的关键词语。
关键词语是概念的一个大致概括，也是概念的浓缩，往往取概念中几个最为重点的词语，来代表整个概念。教师在引导学生把握关键词语时一定要将概念涉及的点先全部列出来，然后每一点选取一个或者多个关键词语，提示学生概念的关键所在，从而提高学生学习生物概念的效率。以植物细胞的结构和各结构的作用为例，教师可以从以下几个关键词语入手，引导学生进行把握。如（1）细胞壁：支持和保护细胞，透明；（2）细胞核：包含植物的遗传信息；（3）细胞质：植物细胞最主要的成分，其中含有大量的物质，主要有液泡和叶绿体，液泡内物质不断流动，加速细胞内、外物质交换；（4）细胞膜：控制物质进出细胞，起到保护细胞的作用。
从上述四个关键词语来看，它们取自于植物细胞相关概念的每一个知识点，然后在其中选取了可以代表每个知识点的词语，用于引导整个概念。这样把生物概念拆分成几个小的部分，再记忆起来就较为方便，将一个繁杂的概念整理得有条理，看起来也较为清晰。这几个关键词语涵盖了植物细胞相关的知识点，如果用这些关键词语来教学，逐步引导学生掌握每个关键词语所代表的内容，学生学习起来就会更容易，且通过记忆关键词语来延伸思考相关的生物概念，学生更能理解生物概念的本质内涵。
二、把握关键词语，理解生物概念的内涵与外延、广义与狭义
1.把握关键词语，理解生物概念的内涵与外延
生物概念具有一定的复杂性，不仅有文字本身代表的含义，还包含着内涵与外延。内涵与外延是概念的基本特征，应用在生物概念上，其内涵指的是生物的生命活动规律与生命现象，外延是指概念包含内容的使用范围和使用条件。为了让学生准确理解概念的内涵与外延，教师应把内涵与外延所包含的内容反映在关键词语上，进而引导学生把握关键词语。
以细胞的分裂过程概念为例，书本上的定义是：细胞从一个细胞分裂成两个细胞，使细胞的数目增多。这个概念的内涵是细胞的数量增加，外延是细胞从一个变成所两个。所以在对这一概念选取关键词语时，有以下两个：
（1）分裂过程：细胞从一个变成两个；
（2）分裂结果：增加了细胞的数量。
通过把握关键词语的方法，将细胞分裂的概念分为了两个关键词语，关键词语中体现了概念的内涵与外延。这样，学生再记忆起来就较为简单。
2.把握关键词语，理解生物概念的广义与狭义
生物概念的广义与狭义是针对概念的外延来说的，如果一个生物概念的外延较大，那么它就是广义的概念；如果概念的外延较小，那么它就是狭义的概念。应用把握关键词语的方法进行生物概念教学时，一定要先区分概念是广义的还是狭义的。
以“染色体”这一生物概念为例，广义的染色体是指在细胞分裂期间呈丝状的染色质，原核生物没有这种物质；狭义的染色体指存在于细胞周期的分裂期，由蛋白质和DNA组成的物质。我们从狭义与广义上理解染色体这一概念是不同的，在把握关键词语时也要考虑到这种因素，这样才可以使概念更加清晰，方便学生的理解。
三、引导学生比较分析相似关键词语
生物概念中，一些名词是十分相似的，但是具体表达的含义却差别很大，在学习的时候学生很容易混淆。所以，在进行生物概念教学时教师要引导学生对相似的关键词语进行比较，使学生明确相似关键词语之间的差别，从而深刻、透彻地理解概念。
以植物细胞和动物细胞为例，两者在字面上都是以细胞为基础，表述的却是完全不同的属性，学生在学习时容易将两者混淆，所以我们要引导学生对两者的关键词语进行比较，以方便学生理解和记忆。
例如，植物细胞的关键词语有：
（1）组成：细胞壁、细胞膜、细胞质、细胞核、液泡、线粒体、绿色部分有叶绿体；
（2）分裂过程：原细胞的中部形成新的细胞膜和细胞壁，然后分裂成两个细胞；
（3）生长表现：生长时先出现较多的小液泡，最终合并成一个大液泡；
（4）细胞分裂时染色体变化：先加倍再减半，两个细胞核的染色体数目与原细胞核的染色体数目相同；
（5）细胞本质：遗传信息的携带者，植物体结构和功能的基本单位。
动物细胞的关键词语有：
（1）组成：细胞膜、细胞质、细胞核、线粒体；
（2）分裂过程：细胞中部的细胞膜向内凹陷，缢裂成两个细胞；
（3）生长过程：从周围环境中吸收营养逐渐长大，细胞的体积也增大；
（4）细胞分裂时染色体变化：先加倍再减半，两个细胞核的染色体数目与原细胞核的染色体数目相同；
（5）细胞本质：遗传信息的携带者，动物体结构和功能的基本单位。
从上述两个概念的关键词语可以看出，植物细胞与动物细胞有着本质的差别，而且相关的知识点也比较多，所以学生在记忆时才会出现混淆的现象。教师在进行生物概念教学时可以把两个概念的关键词语比较分析，重点指出两者的不同之处。这样利用把握关键词语 [本文由WWw.DYLw.NET提供，第 一论 文网进行和服务，欢迎光DYlw.NeT 联系方式QQ 712086966]的方法，使学生可以重点记忆和理解易错的知识，简化了学习的复杂性。同时，这种比较关键词语的方法还可以增强学生的学习效果。学生在学习与复习一个关键词语时，自然而然地就会想到另一个关键词语，生物概念的学习效果显著增强。
生物是一门特殊的学科，它虽然被归类为理科，但是它有较多的知识点需要记忆，而且生物概念十分繁杂，记忆起来比较困难。所以，在生物概念教学中可以用把握关键词语的方法，将生物概念划分成不同的小份，以方便学生理解和记忆。这种方法在概念教学中有很好的效果，可以极大地提高生物概念教学的效率和学生学习的积极性。
[ 参 考 文 献 ]
【关键词】 端粒酶 肝癌 反义寡核苷酸 细胞凋亡
0 引言
我国为肝癌高发国家，据统计肝癌位居男性肿瘤患者死亡原因的第二位［1］。肝癌的发生发展与端粒酶激活密切相关。端粒酶由三部分组成，即端粒酶rna、端粒酶逆转录酶和端粒酶相关蛋白。端粒酶在行使其功能合成染色体末端端粒序列时必须以自身的rna为模板［2］。端粒酶rna由450 个核苷酸组成，其中11个核苷酸为端粒合成的模板序列。我们设想，封闭端粒酶rna的模板序列，干扰端粒酶向染色体末端添加端粒序列的过程, 使癌细胞端粒长度的稳定机制破坏，就可使永生化细胞的癌细胞无限增殖受限，从根本上抑制肿瘤细胞生长。本实验目的在于观察靶向端粒酶模板区的硫代反义寡核苷酸对肝癌细胞端粒酶活性及肿瘤细胞生长的影响，为肝癌治疗探索一条新的、有效的途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞株 肝癌细胞株smmc²7721，正常肝细胞株l²02，购自中科院上海细胞生物技术研究所。
1.1.2 trap反应试剂、tunel检测试剂、western单抗为宝灵曼公司产品。
1.1.3 聚丙烯酰胺银染试剂 硝酸银(agno3)，无水碳酸钠(na2co3)，购自华美生物公司。
1.1.4 仪器 beckman cs²15r低温离心机，perkin²elmer gene pcr仪，mk²2酶标仪。
1.2 方法
1.2.1 端粒酶反义dna的设计 选择近端粒酶 rna 模板区的20个核苷酸为反义靶位，设计合成端粒酶反义 dna 序列、正义序列、随机序列，见表1。硫代反义dna由中科院上海细胞所合成与纯化，纯度达98%以上。
表1 端粒酶模板区反义、正义及随机序列（略）
tab 1 the sequence of sense, anti²sense and control²scrabled
1.2.2 trap²pcr²elisa检测肿瘤细胞端粒酶活性［3］。
1.2.3 合成dna对肝癌细胞端粒酶活性的影响 1×106 smmc²7721培养于nunclon 24 孔板，培养液1ml含10% 热灭活小牛血清、50u/ml青霉素、50μg/ml链霉素，培养条件为37℃、5% co2 。正义、随机、反义dna终浓度为10μmol/l，以pbs为对照，作用时间分别为12、24、36、48、60h，培养结束后胰酶消化，pbs洗2次，trap²elisa法定量测定端粒酶活性，每一dna设3复孔。进一步观察倍比稀释后的端粒酶反义dna（浓度为10、5、2.5、1.25μmol/l）作用不同时间对细胞端粒酶活性的影响。
1.2.4 凋亡研究
(1)tunel染色观察细胞染色及细胞调亡 4×105/ml培养细胞种植于12孔细胞培养板，不同寡核苷酸作用14天后pbs洗涤2次进行细胞爬片，按tunel试剂盒说明对细胞进行固定、通透、标记反应，苏木素染色，封片，拍照。
(2)流式细胞仪细胞周期分析 1×104细胞经5μmol/l反义dna作用14天的细胞进行细胞周期时相分析。
(3)dna抽提及电泳 将1×106经反义dna作用14天的细胞移入1.5ml离心管，加裂解液及蛋白酶²k，55℃水浴20min，加rna酶 10μl 作用2min，酚、氯仿²异戊醇各抽提1次，加3m乙酸钠、无水乙醇沉淀dna，3000g离心10min，气干，te溶解沉淀。 取抽提好的dna 5μl，在1.8%琼脂糖凝胶、5v/cm电压下，电泳3h，以hind² ⅲ酶切的λdna为分子标志，302nm紫外光透照并照相。
1.2.5 western分析细胞周期相关蛋白 收集经反义dna作用14天的smmc²7721肝癌细胞（以未作任何处理的smmc²7721阴性对照），裂解液裂解，蛋白产物进行sds²page电泳（15%浓缩胶，5%分离胶），电泳产物半干电转移至nc膜上（转移时间p21为45min，cyclind1、cdk2为1h），50g/l脱脂奶粉室温封闭4h，tbs漂洗3次，分别加入抗小鼠cyclind1，抗兔cdk2、p21单克隆抗体及作为内参照的β²actin单克隆抗体，4℃过夜反应，tbs漂洗3次，再加入相应二抗，室温反应4h，tbs漂洗3次后，dab显色。
1.3 统计学方法
方差分析,p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 合成反义、正义、随机序列dna作用不同时间对肝癌细胞株smmc²7721端粒酶活性的影响
10μmol/l合成端粒酶反义dna对肝癌细胞端粒酶活性具有显著抑制作用，这种抑制作用开始于12h，60h端粒酶活性被完全抑制，而正义链及随机链对细胞端粒酶活性无显著影响，见表2、图1。
表2 合成dna对smmc²7721细胞端粒酶活性的影响（1×10 6/ml） （略）
tab 2 the effection of synthesised dna on telomerase activity（1×10 6/ml）
*：the difference is significant compared to the control，p<0.01
a:control scrambled;b:sense;c: anti²sense
图1 端粒酶反义寡核苷酸对端粒酶活性的抑制作用（略）
fig 1 the inhibitory effect of anti²sense telomerase oligonucleotide for telomerase activity
2.2 反义寡核苷酸对肝癌细胞的凋亡诱导作用
2.2.1 tunel标记 在倒置显微镜下我们观察反义寡核苷酸作用14天的细胞，发现60%的癌细胞被染成棕色，并有凋亡小体的产生，凋亡细胞数显著高于正义序列，见图2。
a: anti²sense light microscope(×800)；b: sense light microscope(×400)
图2 端粒酶反义及正义寡核苷酸作用14天tunel染色（略）
fig 2 tunel staining for smmc²7721 after anti²sense and sense telomerase oligonucleotide affected for 14 days
2.2.2 dna电泳 反义寡核苷酸作用14天，光镜下癌细胞呈凋亡改变，dna抽提电泳出现凋亡条带，见图3。
a:genomic;b,c:anti²sense;d:sense
图3 端粒酶反义寡核苷酸作用14天细胞dna电泳图（略）
fig 3 the dna electrophoresis after anti²sense telomerase oligonucleotide affected for 14 days
2.2.3 端粒酶活性与细胞周期的关系 合成dna与1×104/ml细胞共育2周，反义dna在端粒酶活性被抑制后,s期细胞百分数下降,而g2/m期细胞百分数增高，细胞聚集于g2/m期，见表3。
表3 端粒酶dna对细胞周期的影响（n=3）（略）
tab 3 the effection of telomerase dna on the cell cycle（n=3）
*：the difference is significant compared to the control，p<0.012.3 细胞周期调控因子检测结果
反义寡核苷酸作用的肝癌细胞培养14天后收集裂解细胞总蛋白，以β²actin作内对照，western blot技术检测cyclind1(细胞周期素)、cdk2(细胞周期素依赖性蛋白激酶)和p21（细胞周期素依赖性激酶抑制因子）的表达，结果显示在β²actin等量的情况下，与正义序列比较反义寡核苷酸作用的肝癌细胞cyclind1、cdk2的表达下降而p21蛋白的表达显著增加，见图4。
图4 端粒酶反义dna作用后smmc²7721细胞周期相关蛋白的表达（略）
fig 4 the expression of cell cyclin after telomerase²antisense dna affected
3 讨论
我国为病毒性肝炎高发国家，病毒性肝炎相关肝硬化、肝癌的发生率居高不下。病毒感染可造成肝细胞变性坏死、假小叶形成。肝细胞在不断坏死及增殖过程中与病毒核酸整合而造成肝细胞端粒酶激活、无限增殖、永生化而恶变。因此，端粒酶激活在肝细胞癌变及其恶性增殖中起决定性作用［4］。端粒酶是核糖核蛋白复合体，主要功能是向分裂细胞染色体末端添加端粒重复序列以保证肿瘤细胞的无限增殖。
肿瘤细胞因端粒酶激活而恶性增殖，因此，用反义核酸来抑制或消除肿瘤细胞端粒酶活性成为近年肿瘤治疗研究的热点，核酸类药物抗肿瘤具有广泛临床应用前景［5］。研究指出：在寡脱氧核苷酸上通过共价连接引入一定的活性基团，可使该寡核苷酸耦合物除具有一般寡核苷酸特性外，其耐核酸酶能力、与靶核酸分子结合的强度及细胞对寡核苷酸摄取等均显著增强[6]， 修饰的寡核苷酸被认为是选择性抑制基因表达的新工具和抗肿瘤治疗最有前途的新药。我们对靶向端粒酶模板区的反义dna的研究发现：反义dna能识别并与端粒酶模板rna结合而抑制肝癌细胞端粒酶活性，端粒酶活性的下降具有浓度依赖性，10μmol/l的反义dna作用12h即开始产生抑制作用，继续作用60h端粒酶活性几乎完全被抑制，实验中反义dna作用的时间延搁为12h，可能与其进入细胞的过程有关［7］。
随着肝癌细胞端粒酶活性的被抑制，肿瘤细胞出现生长阻滞，因此，端粒酶反义dna抑制肿瘤细胞增殖是通过抑制其端粒酶活性实现的。肝癌细胞端粒酶活性的抑制，意味着癌细胞失去了赖以永生化的物质基础而转为“非永生化”。
凋亡研究结果显示:端粒酶失活的癌细胞继续培养，细胞活力显著下降并出现调亡。端粒酶反义dna与肝癌细胞共育14天后，tunel染色60%的癌细胞被染成棕色，形态学上表现核深染、染色质边集、核碎裂及凋亡小体形成；细胞dna电泳呈凋亡特征性ladder，流式细胞仪研究显示s期细胞的百分数显著下降，说明发生凋亡的细胞为处于细胞周期s期的细胞[8]。
western杂交结果显示反义dna作用的肝癌细胞cdk2、cyclind1的表达量下调而p21表达增加。这就意味着端粒酶反义dna通过对端粒酶活性的抑制而影响了细胞p21的表达。有研究表明细胞周期监控机制的破坏可导致细胞基因组不稳定和基因突变，肿瘤细胞cyclind1的过度表达可缩短肿瘤细胞g1期使细胞持续生长，而p21的高表达则抑制肿瘤增殖并促进其发生分化[9]， p21能与cdk2结合形成稳定的复合物，阻止其与cyclind1的结合。我们所合成的端粒酶反义dna有可能通过细胞周期因子cyclind1、cdk2和p21的调控来抑制肝癌细胞的增殖。
端粒酶反义dna分子特异地与细胞内端粒酶rna结合，但对染色体端粒酶基因并无封闭作用，因此，反义dna对端粒酶活性的抑制是可逆的。我们将去除反义分子的细胞继续培养20天，端粒酶弱表达且不能恢复到原来的水平，发生这种现象的原因可能与下列因素有关：（1）进入细胞内的反义dna有足够量结合新转录的端粒酶rna模板序列；（2）端粒酶发挥作用必须以全酶的形式，端粒酶蛋白质成分在端粒酶活性调控中起主要作用，反义分子与端粒酶 rna 结合后可影响其蛋白质亚单位的构象或功能而影响端粒酶活性，即使细胞端粒酶rna基因有转录，其蛋白质成分也不能发挥作用；（3）端粒酶在细胞内被灭活后, 肿瘤细胞自身也发生了一系列的变化，如分化、老化及凋亡，端粒酶活性均显著降低［10］。
总之，我们的研究表明，端粒酶反义dna能抑制肝癌细胞端粒酶活性，并通过此途径抑制肝癌细胞增殖、使s期细胞凋亡。靶向端粒酶的核酸类药物有潜在临床应用前景，值得进一步研究。
【参考文献】
［1］ bu x,jia f,wang w,et al. coupled down-regulation of mtor and telomerase activity during fluorouracil²induced apoptosis of hepatocarcinoma cells［j］. bmc cancer, 2007,7:208.
［2］ gryaznov sm, jackson s, dikmen g,et al. oligonucleotide conjugate grn163l targeting human telomerase as potential anticancer and antimetastatic agent［j］. nucleosides nucleotides nucleic acids, 2007, 26(10²12):1577²1579.
［3］ 邓志华，韩子岩，王琦，等.抑制端粒酶活性对as2o3诱导肝癌细胞凋亡的影响［j］.中国肿瘤生物治疗杂志，2006，13（6）：457²461.
【摘要】 目的 应用单核细胞向巨噬细胞分化的体外模型，研究单核细胞向巨噬细胞细胞分化过程中基质金属蛋白酶-9表达及其活性的变化.方法用乙酸肉豆蔻佛波酯(PMA) 孵育THP-1细胞不同时间，采用倒置显微镜观察细胞的形态学变化，RT-PCR观察MMP-9 mRNA表达的变化，Western blot观察MMP-9蛋白表达的变化，明胶酶谱(gelatin-zymogram)分析法测定MMP-9活性的变化。结果THP-1细胞经PMA孵育后, 细胞由分散、悬浮转变为黏附、贴壁, 且MMP-9的表达明显上调，活性增加.结论 单核细胞向巨噬细胞分化的过程中，MMP-9的表达量及其活性明显增加。
关键词：PMA 单核细胞 巨噬细胞 基质金属蛋白酶9
1 前言
MMP－9 是明胶酶的一种,单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、血管平滑肌细胞、以及内皮细胞等均有表达[1]，参与降解细胞外基质（ECM）,在多种生理和病理过程中起着重要作用。为此，我们采用单核细胞向巨噬细胞分化的体外模型，探讨单核细胞在分化为巨噬细胞的过程中MMP-9表达的变化，进一步探讨动脉粥样硬化发生发展的机制。
2 材料和方法
2.1 THP-1细胞培养
THP-1细胞购自中科院上海细胞生物所细胞中心。含10%小牛血清RPMI-1640培养基在37℃、5%CO2条件下培养至106/ml时换无血清培养基，加PMA（至终浓度为100nM）[2]，分别孵育6、12和24小时。
2.2 RT-PCR检测MMP-9 mRNA的表达[3]
用TRIZOL RNA抽提液提取细胞总RNA,RNA浓度以紫外分光光度计(美国PE公司Lambda25型)重复测量3次,A260nm/A280nm比值在1.8以上方可用。取1.0μg总RNA为模板，以Oligo（dT）16为引物进行逆转录。反应条件为65℃变性5min，42℃反应50min,70℃终止反应15min。扩增MMP-9的引物为：有意义序列引物5’-CGGGACGGCAATGCTGATG-3’,反义序列引物5’-CGCCACGAGGAACAAACTGT-3’, 预计扩增引物全长为362bp。以3-磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）为内对照，扩增GAPDH引物为：有意义引物序列5’TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3’， 5’TCACCATCTTCCAGGAGCGAG 3’,下反义序列引物:5’TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG 3’,预计扩增引物全长为697bp,均由上海生工合成。取逆转录产物2μL分别进行聚合酶链反应。反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，退火45s，72℃延伸1min。退火温度SDF-1为58℃，GAPDH为58℃。经28个循环后，72℃延伸10min。取5μL聚合酶链反应产物作琼脂糖凝胶电泳。并利用凝胶成像系统作结果分析。
2.3 Western blot 检测MMP-9蛋白表达
经8%SDS-PAGE分离样品蛋白质，转移缓冲液在200mA、100V条件下电泳6h后转膜，洗膜，封闭液封闭。分别加入一抗，4℃轻轻振荡约2h，漂洗，加过HRP标记的二抗杂交，再漂洗，显色液显色，暗室中感光，拍照并进行灰度扫描测定。
2.4 明胶酶谱法测定MMP-9活性[4]
酶原电泳在含0.1%明胶、10%SDS的8%聚丙烯酰胺凝胶中进行。电泳完毕后，将凝胶浸入2.5%Triton-100中复性30min，共2次，洗去SDS，恢复MMP-2、MMP-9活性。再将凝胶浸入酶解缓冲液（50mmol/L Tris-HCl，pH 7.6、0.2mol/L NaCl、5mmol/LCaCl2、0.02%Brij35），温育37℃ 18小时。用0.5%考马斯亮兰（10%冰醋酸、40%甲醇配制）染色90min后，10%冰醋酸、40%甲醇脱色至透明条带与兰色背景对比清晰即可。凝胶扫描，半定量测定MMP-9活性。
2.5 统计学处理
实验数据用平均数±标准差( ±S)表示。采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析，两两均数间的多重比较，采用Student t检验，P
3 结果
3.1 PMA处理对THP-1细胞形态的影响
THP-1细胞和PMA孵育6h后，细胞形态开始发生改变，由悬浮型转变为贴壁型，到24h时，基本贴璧，但细胞外型依然为圆形，细胞表面伸出伪足，细胞体积增大，胞浆内出现空泡。
3.2 PMA对THP-1细胞 MMP-9 mRNA表达的影响
RT-PCR结果表明，在单核细胞中有MMP-9 mRNA基础表达，在经PMA孵育后，随着孵育时间的延长，MMP-9 mRNA表达量明显增加。
3.3 PMA对THP-1细胞 MMP-9 蛋白表达的影响
Western blot检测结果表明，与RT-PCR检测结果基本一致，在单核细胞中即有MMP-9蛋白表达，在经PMA孵育后，随着PMA孵育时间的延长，MMP-9蛋白表达量明显增加，到6h时，与对照组相比，差异具有显著性（P
3.4 PMA对THP-1细胞 MMP-9活性的影响
用含明胶的SDS-PAGE 对培养液上清中的MMP-9活性检测结果表明，在经PMA孵育后，在单核细胞分化为巨噬细胞的过程中，MMP－9的活性明显增加。
4 讨论
循环血液中的单核细胞在黏附分子和单核细胞趋化蛋白的作用下，黏附于血管内皮，再穿过内皮细胞间连接迁入内皮下间隙。进入内皮下间隙的单核细胞被激活，分化为巨噬细胞。Shigeru等证实在将单核细胞与PMA孵育24小时后转化为成熟的巨噬细胞，为良好的体外单核细胞分化为巨噬细胞细胞模型。在我们的实验中，我们也观察到单核细胞与PMA孵育后，到6h时，细胞表型即发生了明显变化，细胞开始贴璧，到24h时，细胞几乎完全贴璧，并且细胞体积增大，细胞边缘伸出伪足，胞浆内出现空泡，形成巨噬细胞的形态结构。
在AS 损伤中,富含脂质的巨噬源性泡沫细胞聚集是易破斑块的重要特征,其中病灶区MMP－9表达的增加可能在斑块破裂中起重要作用 [5]。对AS 高胆固醇血症的家兔模型的动脉损伤处分离的细胞进行培养,发现这种明胶水解活性酶主要来源自巨噬源性泡沫细胞。我们的研究进一步发现，在单核细胞分化为巨噬细胞过程中，尚未形成泡沫细胞，MMP-9的表达量与活性即有明显上调。因此我们推测在单核细胞分化为巨噬细胞的过程中，MMP－9的表达及活性增加,一方面增加ECM的降解,从而有利于平滑肌细胞的迁移，促进动脉粥样硬化病变的发生和发展，另一方面加速斑块中胶原的降解，从而降低斑块的强度，促使斑块破裂。
综上所述，在单核细胞分化为巨噬细胞过程中，MMP-9表达量及活性的改变，可能对动脉粥样硬化的发生发展以及斑块的稳定性起着重要的调节作用。
参考文献
1 王梅芳,杨林花. MMP-9 与冠状动脉粥样硬化. 临床心血管病杂志. 2004，20 （11 ）：699－701.
2 周筠, 朱平, 蒋建利, 等. PMA诱导的THP21细胞分化过程中MMP29及MMP22的表达与细胞侵蚀性的关系. 细胞与分子免疫学杂志. 2005, 21 (2)：256－257.
3 吕运成，王佐，危当恒，等. 基质细胞衍生因子1α―CXCR4趋化THP-1细胞迁移及氧化型低密度脂蛋白的影响. 中国动脉硬化杂志. 2007，15（1）：15－18.
【摘要】 目的 探讨PI3K/Akt抑制剂LY294002〔2（4吗啉基）8苯基4氢1苯并吡喃4酮〕联合化疗药物顺铂（DDP）治疗肺癌的效应及可能机制，以期为肺癌的临床治疗提供新的理论依据。方法 培养肺腺癌A549细胞，采用MTT方法及流式细胞仪检测LY294002联合DDP对A549细胞增殖及凋亡的影响；通过裸鼠移植瘤实验检测LY294002联合DDP对A549细胞成瘤性的影响。结果 在一定剂量范围内，LY294002与DDP均可抑制A549细胞的生长，其抑制作用呈量效关系。LY294002与DDP联合作用可增强对A549细胞的抑制作用。LY294002与DDP均可有效的诱导A549细胞凋亡，联用后凋亡率显著增加。裸鼠移植瘤实验显示，LY294002与DDP均可抑制移植瘤的生长，联用后抑瘤率增加。结论 LY294002可增强DDP对A549细胞、裸鼠移植瘤的抗肿瘤作用，该作用可能是通过增强对A549细胞增殖的抑制以及诱导其凋亡来实现的。
【关键词】 肺肿瘤；凋亡；PI3K；LY294002；顺铂
细胞生存信号的转导对肺癌的发生发展起着至关重要的作用。PI3K/Akt信号转导通路在国外被视为癌细胞存活的首要通路。近年来对Akt的研究发现，Akt能够通过磷酸化其下游的多种作用底物促进对化疗和放疗的抵抗。PI3K/Akt抑制剂LY294002〔2 (4吗琳基)8苯基4氢1苯并毗喃4酮〕可增强某些抗肿瘤药物的疗效，减少化疗抵抗〔1，2〕。而LY294002对肺癌的研究还处于初始阶段，本研究旨在对PI3K/Akt的抑制剂LY294002与化疗药物顺铂（cisplatin，DDP）联用对肺癌细胞株A549及裸鼠移植瘤的生长抑制作用及其机制进行探讨，为肺癌治疗提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 细胞株与试剂 人肺腺癌细胞株A549购自中科院上海细胞生物研究院；F12K培养基、LY294002及噻唑蓝(MTT)购自sigma公司；胎牛血清购自中国医学科学院生物工程研究所；DDP（云南个旧生物药业有限公司，国药准字@53021740）；裸鼠由北京大学医学院实验动物中心提供。
1.2 细胞培养 A549细胞用F12K培养基，于37℃、5%CO2培养箱内培养。细胞为贴壁生长，0.25%胰蛋白酶消化传代。
1.3 MTT比色分析法 检测LY294002对A549细胞生长抑制作用。取对数生长期A549细胞按1×104/孔接种于96孔培养板，每孔加液量200 μl。于培养24 h后换液，设空白调零组(不接种细胞)、对照组(只含等量溶剂)及实验组(加不同浓度的DDP，DDP浓度依次为0.5、1、2、4、8、16 μg/ml，每组LY294002终浓度分别为20 μmol/L)，每组设6个复孔。于培养48 h后加入MTT(5 g/L)20 μl，继续培养4 h后吸出上清，每孔加二甲基亚砜（DMSO）150 μl，振荡溶解10 min，待结晶完全溶解后，在酶联免疫测定仪上选择波长490 nm，空白孔调零，测定各孔吸光度A。计算细胞生长的抑制率，抑制率=(1-实验组A平均值/对照组A平均值)×100%。
1.4 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡率的变化 取对数生长期的A549细胞，调整细胞浓度为2×105/ml接种于培养瓶，加入上述不同浓度的药物（LY294002终浓度为20 μmol/L， DDP终浓度别为3 μg/ml），培养48 h后获取细胞，制成单细胞悬液， 4℃ 70%冷乙醇固定，放置4℃冰箱固定12 h以上。检测时，弃去乙醇，加入0.5%胃蛋白酶1 ml（pH值 1.5～2.0）消化，采用碘化丙锭（PI）一步插入性DNA定量荧光染色法，上机检测细胞周期和细胞凋亡率。
1.5 裸鼠移植瘤模型的建立与干预 24只裸鼠，均为雌性，鼠龄为3～4 w，体重约18～20 g，实验和饲养均在无特定病原（SPF）条件下进行。随机将裸鼠分为4组：对照组、LY294002组、DDP组和LY294002+DDP组，每组6只，于裸鼠右上背部皮下接种对数生长期的A549细胞1×107/0.2 ml。待1 w后肿瘤长出。①LY294002组：给予LY294002 25 mg/kg，腹腔注射，每周2次；②对照组：等量生理盐水，腹腔注射；③DDP组：给予DDP 4 mg/kg，腹腔注射；④LY294002＋DDP组： LY294002 25 mg/kg＋DDP 4 mg/kg，腹腔注射；共3 w。裸鼠于最后注射药物2 d后处死，用药3 w。实验中注意观察裸鼠精神、进食、排便及体重情况，隔日测裸鼠体重及移植瘤直径。实验结束取出移植瘤，注意肿瘤转移情况，称重瘤结节，计算抑瘤率：抑瘤率（％）＝（对照组瘤结节重量-各实验组瘤结节重量）/对照组瘤结节重量×100％。取LY294002组及LY294002＋DDP组裸鼠肝、胃及肠做HE染色。
1.6 统计学方法 计量资料用x±s表示，用SPSS13.0统计软件行单因素方差分析和Pearson相关分析，率的比较采用χ2检验。
2 结果
2.1 LY294002联合DDP对A549细胞生长的抑制效应 MTT结果显示：LY294002浓度分别为5、10、20、40 μmol/L时，其抑制率分别为：26.94％、34.33％、42.53％、49.88％，可见在一定的浓度范围内，随着LY294002剂量的增加，其抑制率增加。根据LY294002对A549细胞的抑制效应选用LY294002浓度为20 μmol/L 作为与DDP联合的干预浓度。见表1。
由表1可以看出：DDP单用时，浓度达1 μg/ml可显示抑制A549细胞的增殖，抑制率为11.41％，各浓度组与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；随着浓度的增大，抑制作用增大，呈剂量效应关系（r＝0.808，P＜0.05）。LY294002与DDP联用时，DDP浓度为0.5 μg/ml即可显示出抑制A549细胞的增殖，抑制率为9.65％。各浓度组与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。LY294002+DDP各浓度组与DDP单独作用对应各浓度组相比，DDP浓度为0.5 μg/ml和1 μg/ml时，抑制率的差异有统计学意义（P＜0.05）。当DDP浓度再增加，各药物联合组抑制率与DDP单用组相比，有增高的趋势，但其差异无统计学意义（P＞0.05)。低浓度组，药物联合组抑制率与DDP单用组相比，差别较大，DDP浓度越高，其差别越小。
2.2 LY294002与DDP联用对A549细胞周期及凋亡率的影响 DDP、LY294002及LY294002与DDP联用干预A549细胞后，各药物组凋亡率与对照组相比差异均有统计学意义（P＜0.01）；DDP＋LY294002组与DDP组及LY294002组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。细胞周期分布与对照组相比都发生变化，表现为S期和G2/M期细胞减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。LY294002+DDP组细胞与DDP或LY294002单独作用于A549细胞相比，S期和G2/M期细胞减少（P＜0.05）。见表2。
2.3 LY294002联合DDP对裸鼠移植瘤生长的影响 裸鼠皮下接种A549细胞后，约1 w左右见皮下移植瘤出现，呈圆形或椭圆形结节。在实验过程中，各组裸鼠均未出现精神、进食、排便的明显异常及死亡。各组间裸鼠体重无明显差异（P＞0.05）。LY294002、DDP组、DDP+LY294002组瘤结节重量均低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。DDP+LY294002组瘤结节重量又低于LY294002、DDP组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。LY294002、DDP组、DDP+LY294002组的抑瘤率分别为40.3％、43.53％和67.46％，提示LY294002与DDP均能抑制裸鼠移植瘤的生长，两者联合应用抑瘤作用强于单独应用。见表3。
表1 LY294002与DDP联用对A549细胞生长的抑制效应（略）
与对照组相比：1）P＜0.05，2）P＜0.01；与DDP单用组相比：3）P＜0.05
表2 LY294002联合DDP或紫杉醇对A549细胞周期的影响（略）
与对照组相比：1）P＜0.05，2）P＜0.01；与DDP组相比：3）P＜0.05；与LY294002组相比：4）P＜0.05
表3 LY294002联合DDP对裸鼠移植瘤生长的抑制效应（略）
与对照组相比：1）P＜0.01；与LY294002组相比：2）P＜0.01；DDP组相比：3）P＜0.01
3 讨论
非小细胞肺癌（NSCLC）约75％的肺癌患者在发现时已属晚期〔3〕，放、化疗对各期病人均为重要的治疗方法。而单纯采用化疗或放疗效果并不令人满意。研究证实DDP等化疗药物除直接杀伤肿瘤细胞外，还可诱导肿瘤细胞进入凋亡程序，由此推论，凋亡是耐药产生的共同途径〔4〕，细胞凋亡能力可直接影响化疗药物的效应〔5〕。肿瘤细胞可通过抑制进入凋亡程序，表现出对化疗药物的耐受性，是肿瘤细胞所具有的自我保护功能之一。选择性诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤治疗的一条途径，有可能改善患者的预后〔6〕。P13K信号转导通路具有调节细胞的增殖、生存和分化等功能，PI3K可上调抗凋亡基因的表达，抑制由cmyc诱导的细胞凋亡〔7〕，以抑制细胞进入凋亡程序，促进细胞生存，因此推测P13K信号转导通路可能在多细胞耐药中发挥作用。最近肿瘤分子靶向治疗研究发现信号转导途径与肿瘤进展和放、化疗抵抗有密切的关系。PI3K/Akt抑制剂在体外可抑制多种肿瘤细胞的生长，导致肿瘤细胞凋亡〔8，9〕。近年的研究还发现PI3K/Akt抑制剂LY294002可增强某些抗肿瘤药物的疗效，减少化疗抵抗〔2，10〕。
本研究显示，DDP及LY294002对A549细胞的增殖有显著抑制作用，二者联用与单独干预相比对A549细胞增殖的抑制作用增强，说明LY294002有增加化疗药物治疗效果的趋势。DDP与LY294002均可影响细胞周期的分布，使细胞阻滞于G0/G1期，二者联用后，该作用增强。裸鼠移植瘤体内实验结果表明LY294002、DDP均能抑制裸鼠移植瘤的生长，LY294002与DDP联用时抑瘤率增加，说明LY294002能促进DDP的抑瘤效应。以上作用可能是通过以下3方面来实现的：①LY294002使细胞周期阻滞G0/G1期，抑制细胞的增殖；②LY294002促进细胞的凋亡；③有研究发现〔11〕若将P13K亚单位基因引入体外细胞系中，可使PI3K/Akt信号转导通路活性增强，细胞对化疗药物的敏感性会随之降低，耐药性增强。说明LY294002也可能通过增强对信号转导通路的调控增强肿瘤细胞对DDP的敏感性，从而使DDP的化疗效果增强。本研究过程中各组裸鼠均未出现精神、进食、排便的明显异常及死亡。实验结束后各处理组裸鼠体重亦无显著差异，解剖未见远处及局部淋巴结转移，各组肝、胃及肠道等重要脏器的HE染色未发现明显差异，说明LY294002在体内应用相对来说是安全的。但LY294002对人体是否有毒副作用及增加化疗药物的抗癌效果，由于细胞内及动物脏器的生理特点与人类有差别，还需要进一步的研究去证实。
本研究认为，LY294002可促进Akt高表达肿瘤的抗肿瘤药物的疗效，而对于Akt低表达的肿瘤化疗效果无影响，其促进化疗疗效的作用主要是通过促进细胞凋亡实现的。而Howells等〔12〕在应用LY294002作用于乳腺癌细胞时，却发现其抑制癌细胞增殖与导致细胞凋亡并无直接关系。因此，LY294002本身抗肿瘤及与化疗的协同作用具体机制还不清楚，还存在许多悬而未决的问题，仍需进一步的更加精确的研究证实。
参考文献
1 Westfall SD，Skinner MK.Inhibition of phosphatidylinositol 3kinase sensitizes ovarian cancer cells to carboplatin and allows adjunct chemotherapy treatment〔J〕.Mol Cancer Ther，2005；4(11):176471.
2 Brognard J，Clark AS，Ni Y，et al.Akt/protein kinase B is constitutively active in nonsmall cell lung cancer cells and promotes cellular survival and resistance to chemotherapy and radiation〔J〕.Cancer Res，2001；61(10)：398697.
3 段庚仙.非小细胞肺癌治疗现状〔J〕.肿瘤研究与临床，2003；15（4）：75678.
4 Han JY，Chung YJ，Park SW，et al.The relationship between cisplatininduced apoptosis and p53，bcl2 and bax expression in human lung cancer cells〔J〕.Korean J Intern Med，1999；14(1)：4252.
5 汤钊猷.现代肿瘤学〔M〕.第2版.上海:上海医科大学出版社，2000：461.
6 Fulda S.Targeting inhibitor of apoptosis proteins(IAPs) for cancer therapy〔J〕.Anticancer Agents Med Chem，2008;8(5):5339.
7 Hannigan GE，Dedhar S.Protein kinase mediators of integrin signal transduction〔J〕.J Mol Med，1997；75(1):3544.
8 Alexia C，Bras M，Fallot G，et al.Pleiotropic effects of PI3′ kinase/Akt signaling in human hepatoma cell proliferation and druginduced apoptosis〔J〕.Ann N Y Acad Sci，2006;1090:117.
9 Poh TW，Pervaiz S.LY294002 and LY303511 sensitize tumor cells to druginduced apoptosis via intracellular hydrogen peroxide production independent of the phosphoinositide 3kinaseAkt pathway〔J〕.Cancer Res，2005；65(14):626474.
10 Page C，Lin HJ，Jin Y，et al.Overexpression of Akt/Akt can modulate chemotherapyinduced apoptosis〔J〕.Anticancer Res，2000;20（1）:40716.
中医理论中，五行相克的生物学含义就是能量代谢的过程，以此为原则，可以对现有解剖器官进行重新划分（文章待发表）。虽然如此，五行相生的生物学含义还是很模糊。中医五行学说中相生相克是紧密联系的，仅阐明相克而没阐明相生就很难被认为是在遵从中医的理论。中医认为先天之本在于肾，后天之本在于脾。如果分别从肾和脾入手，五行可以被分拆为四个环，即先天相生环、相克环和后天相生环、相克环。后天相克环起点为脾，生物学实质就是能量代谢过程。先天相生环起点为肾，生物学实质没有得到阐述，只有将这个环的生物学本质进行阐明后，中医理论中最核心的问题才能最终得到解决。
1 中医脏腑理论中肾的功能
现代中医理论认为，肾的主要生理功能包括：主藏精，主水，主纳气[1]。肾主水，是指肾具有主持和调节水液代谢的作用，这种功能同西医的泌尿系统没有差异。中医界也把泌尿系统纳入脏腑中的肾，男性生殖系统归为脏腑中的肾后能够部分解决肾藏精的问题，但仍让人感到欠缺。了解肾精的生物学含义是解决中医五行相生的着眼点。
肾藏精是指肾具有封藏和存储人体精气的作用。《素问・六节藏象论》说：“肾者，主蛰，封藏之本，精之处也。”精的含义有广义和狭义之分。狭义之精是指禀受于父母而储藏于肾的具有生殖繁衍作用的精微物质，又称生殖之精。这相当于解剖中的生殖系统，特别是男性生殖系统。广义之精泛指构成人体及维持人体生长发育、生殖和脏腑活动的精微物质，是生命之源，故《素问・金匮真言论》说：“夫精者，身之本也。”精的来源有两种，即先天之精和后天之精。先天之精又称肾本脏之精，是禀受于父母，与生俱来的构成人体原始生命物质；后天之精又称五腑六脏之精，是由脾胃化生并灌溉五腑六脏的水谷精微[1]。
这里五谷之精和西医所指的营养物质几乎没有差别。而先天之精，即肾精的含义远超出了现代西医泌尿生殖系统的功能。中医没有结合现代生物学、生理学等学科来定义肾精的含义，但是也大致描述出肾精的功能特点，这些特点包括：①促进生长发育作用；②主生殖；③化生血液；④抵御外邪[1]。如果能够在现代西医研究成果中找到符合上述特征的解剖结构和细胞系统也就可以被认为是肾精。近些年关于干细胞的研究恰好有利于中医关于肾精的的理解。
2 干细胞研究进展以及与肾精的关系
早在19世纪末，已经有科学家在医学文献中使用“干细胞”这个词。干细胞的研究是在20世纪90年代才不断取得突破、发展，美国《科学》杂志公布的1999年十大科学成果中名列榜首，并于2000年再度入选世界十大科学成果。简单的讲，干细胞是指一类具有无限的或者较长期的自我更新能力而尚未分化的细胞，它能够产生至少一种以上类型的特化细胞。根据这一定义，在个体发育的不同阶段的不同组织均存在着干细胞，只是随着发育过程的延伸，干细胞的数量和分化潜能均逐渐下降[2]。
根据研究的目的不同，干细胞的分类主要有两种方法：一种方法是按其分化潜能的高低将干细胞分为全能干细胞，三胚层干细胞，单胚层干细胞和单能干细胞。另一种方法是根据细胞来源将干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞，前者是指源于囊胚内细胞团的胚胎干细胞和来源于早期胎儿原始生殖嵴的生殖干细胞；成体干细胞是指组织和器官特异性干细胞。现在研究表明，并不是在人体所有组织和细胞中分离鉴定出成体干细胞，而且成体干细胞在数量上是非常少的，很难分离和纯化，且随年龄增长其数目会减少。在现今干细胞的治疗领域，多采用骨髓干细胞作为干细胞的来源，如治疗心肌梗塞、缺血性脑血管意外、脊髓损伤，血管闭塞、慢性肝病等疾病时多采用骨髓干细胞[3-6]。骨髓中造血干细胞仅占骨髓有核细胞的0．5％，以往认为造血干细胞只能分化为红细胞，白细胞等血细胞，而不能生成其它类型的细胞。但在1997年，Egltis等发现将骨髓干细胞移植到骨髓已经被破坏的小鼠体内，结果被植入的骨髓干细胞分化为神经干细胞，这表明骨髓干细胞在一定条件下可以像胚胎一样重新分化，生成其它组织类型的细胞[7]。因此，有人也提出这样的观点：在某种意义上，造血干细胞是全能干细胞存在于成熟个体的一种形式。成熟个体干细胞参与组织损伤的修复可能存在两种形式：一是相应组织内固有的干细胞参与修复，二是组织损伤动员骨髓释放造血干细胞，后者通过血液循环到达组织，在特定的环境下进行增殖分化，最终转化成为该组织细胞，以完成结构和功能的重建，而后者有可能起主导作用[2]。
2．1 促进生长发育作用：受精卵是最全能的干细胞，受精卵形成后就会沿着生命特有的规律进行分裂、增值和分化，多数情况下是会发育成为一个成熟的个体。换而言之，发育成为一个成熟的个体是受精卵功能的体现。受精卵形成过程就是与卵子结合的过程。来源父方，卵子来源于母方，受精卵是禀于父母而形成，这也与肾精的来源相符。
2．2 主生殖：这里需要指出的是，在我们对解剖系统进行五行划分时，女性生殖系统是归于肝木。中医认为，女性之本在于肝，而女性和男性最大的区别在于生殖系统的差别。女性生殖系统中的卵细胞在女性出生是就已经形成，并一直储存在卵巢中，不可能通过干细胞分裂增生而增加，而我们在对五行相克关系进行探讨时也已经指出肝木有物质存储的功能（文章待发表）。女性生殖系统划归肝木即遵循了女性生殖系统的特点，也遵从了中医理论。男性生殖系统与此相反。男性的来源于生精干细胞进行的减数分裂，这种分裂不是出生前后就形成，而是在性成熟后才开始。男性的形成是生精干细胞的功能，因而男性生殖系统划归肾精。
2．3 化生血液：现代西医对骨髓干细胞的最初认识就是血液生成的作用。近来的研究表明，不仅骨髓干细胞可以化生血液，生成多种体细胞，其他的成体干细胞也可以化生血液的功能，如神经干细胞等[7]。
2．4 抵御外邪：干细胞抵御外邪的是通过两种途径。其一，骨髓干细胞通过生成粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞等免疫细胞抵御外源病原体的入侵。其二，在局部组织更新和修复中，组织或者器官特异性干细胞通过自身分裂、增生和分化完成局部组织的修复，如肠粘膜上皮和皮肤上皮细胞的更新。第三，骨髓干细胞可以迁移到受伤组织，转化成为组织特异性干细胞后再分裂为体细胞，从而完成组织修复。
由上述论述可见，干细胞系统基本符合肾精所有功能特征。在此，需要补充说明肾主骨的问题。既往对肾主骨只是从肾脏对钙磷的代谢角度来论述，考虑到骨髓干细胞存在于骨髓腔这一解剖现象，肾主骨就不仅是调节骨质代谢的问题，还有储存和释放干细胞的功能。
2．5 肾精与五行相生的关系：明确肾精的现代生物学含义后，先天五行的起点问题基本得到解决。那么，干细胞同五行相生到底是何种关系，要解决这个问题就先得明确中医整体性的思维方式。
中医思维的整体性是中医学的一大特点。这种整体性体现在对某一生命现象的整体把握上，这种整体把握就需要看到生理现象的出现、增强、顶峰、衰落和消失等过程。我们在讨论五行相克的时候已经明确看到，五行相克所形成的环恰好是能量代谢的整个过程，这个过程可以划分成为五个阶段，并有相应的脏器参与（文章待发表）。在对相生关系进行讨论时就需要从干细胞动员分化一直到体细胞形成这一整体过程来讨论相生。
干细胞最终要发育成为体细胞后才能更有效的完成特定的生理功能，这是一种必然过程。以红细胞生成为例，红细胞是由骨髓干细胞分裂增生而形成。髓系干细胞经过动员，分裂分化成为早期红系祖细胞（BFU-E），晚期红系祖细胞（CFU-E），原始红细胞而最终形成成熟红细胞。只有成熟的红细胞才能参与氧气的输送和转运。在这一过程中，包括各种细胞因子在内的多种调控因素和营养物质的支持是红细胞生成的必要条件。
由红细胞的生成我们可以得到一个一般规律：即体内任何体细胞的形成均要经历由干细胞到体细胞形成的过程。当个体成熟以后，骨髓干细胞成为一种细胞储备，经动员后在一定的环境、多种因素的调控和营养支持的条件下增值分裂并分化成为体细胞。干细胞为肾精，属肾；干细胞的存储和动员属于肝木，肾精由肝木来存储是肝肾同源的理论基础；干细胞增殖分化的调控属于心火的作用；与干细胞分裂分化过程中的营养物质支持为脾土的功能（脾统血）；最终分裂分化完成后归于肺金（肺成形）。这种排列过程基本符合相生的过程。因此母代干细胞形成子代细胞的过程基本就是相生的过程（具体见表1）。
当然，从干细胞分裂形成子体细胞需要通过多次分裂而完成。母代干细胞经历一次相生过程，形成子代细胞，相对于母代干细胞而言，子代干细胞出现一定程度的体细胞化。如果子代细胞仍具有一定分裂分化能力，仍可以被认为是干细胞，并可以进入下一次的相生过程。如果子代细胞为最终的体细胞则将参与能量代谢过程，完成代谢功能后离开相生体系，走向死亡。
3 能量代谢的相克过程和干细胞相生过程的关系
通过对相生相克的探究可以发现，机体内部的相生相克过程是最基本的两个生理过程，相生过程为干细胞的增殖和分化，相克过程为能量代谢过程。这两个过程是相辅相成的，相克过程为相生过程提供能量和物质基础，相生过程为相克过程提供生理结构基础。相克过程为能量代谢，是功能的体现；相生过程为干细胞的增殖分化过程，为生物学基础，并以储备的形式而存在。
虽然如此，我们也只论述了相生和相克环的生物学含义。中医基础理论博大精深，阴阳五行只是核心内容之一，仍有大量的细节需要详细论述。如脏腑五行中各有阴阳，脏腑中的阳为功能体现，为特定的能量代谢过程；阴为储备，体现在干细胞特定的分化过程。在不同的脏腑中，这二者的关系如何？以何种角度、何种方式来结合现代医学、生物学成果来阐述？这些都值得进一步研究。
总之，一阴一阳即为道，能量代谢过程和干细胞相生的过程是部分多细胞生命中最重要的两个环。就人而言，生命的生物学本质就是以干细胞增殖分化为基础的能量代谢过程。
4 参考文献
［1］印会河，童瑶.中医基础理论［M］. 第2版. 北京：人民卫生出版社，2006: 103-105.
［2］裴雪涛主编.干细胞生物学［M］.北京：科学出版社，2003：4-34.
［3］王玲,董淑敏,姜巧珍,等. 干细胞移植治疗下肢动脉闭塞症［J］. 中华心血管杂志, 2006, 34（4）:345-248.
［4］石健，赵新刚，侯铁胜. 骨髓基质干细胞移植与脊髓损伤［J］. 中国矫形外科杂志, 2006, 14 (12):926-928.
［5］郑丽芳，柳卫民，梅元武. 骨髓干细胞动员治疗脑梗死［J］. 国际脑血管病杂志, 2006, 14 (5):373-376.
［6］姚鹏，胡大荣，王帅, 等. 自体骨髓干细胞移植治疗慢性重症肝病临床研究［J］. 透析与人工器官,2006,17(1):18-21.
1 材料与方法
1.1 细胞系
人膀胱癌株t24常规培养。
1.2 寡核苷酸（odns）?脂质体（lip）转染复合物
硫代磷酸修饰的寡核苷酸序列如下：反义序列：5′?cccagccttccagctccttg?3′；正义序列：5′?caaggagctggaaggctggg?3′，均引自gene bank。脂质体lipofectamine2000，按转染试剂盒说明配置不同浓度的odns?lip复合物。
1.3 western blot印迹试验
转染48 h收集细胞，triton试剂提取细胞总蛋白，紫外分光光度仪测定蛋白含量。调整至蛋白浓度2 g/l，取10 μl样品加20 μl样品处理液，95 ℃水浴加热4 min，冷却至室温。于sds?聚丙烯酰胺凝胶中加样品15 μl，指示剂至电泳槽下缘边缘时取出胶版，以电转印仪将蛋白样品转移至硝酸纤维素膜上。以封闭蛋白干粉1 g加0.02 mol/l pbst 100 ml，37 ℃封闭1.5 h。用0.02 mol/l pbst洗涤硝酸纤维素膜。dab染色，照相。重复8次。
1.4 mtt试验
t24细胞起始浓度为1×104/孔。反义odns?lip复合物100、200、400 nmol/l为转染组；正义odns?lip复合物400 nmol/l和空白作为对照组。作用24h、48h及72h后经酶标分析仪于570 nm波长检测吸光度。
1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡变化
取对数生长期的t24细胞，浓度为2×105个/ml。400 nmol/l 反义odns?lip复合物进行转染，对照组应用rpmi?1640培养液。流式细胞仪分别于24 h、48 h及72 h进行细胞凋亡检测。
1.6 统计学方法
采用image tool软件分析western blot图像灰度值，应用单因素方差分析和q检验，p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 western blot印迹试验
反义复合物处理t24细胞48 h，随着浓度增加，survivin蛋白表达水平下降，与正义组和对照组比较差异有统计学意义（p<0.01）。见表1。表1 western blot印迹试验结果(±s)
2.2 mtt法检测细胞抑制率
反义复合物处理t24细胞后，随着浓度与作用时间的增加，细胞生长抑制率逐渐增高，与正义组和对照组比较差异有统计学意义（p<0.01）。见表2。
2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡
t24细胞经作用后，流式细胞仪检测出现典型的亚二倍体峰，且亚二倍体峰的峰值随处理时间的延长而增加，与正义组和对照组比较差异有统计学意义（p<0.01）。见表3。表3 400 nmol/l反义寡核苷酸作用不同时间后细胞凋亡率
3 讨论
survivin是一些恶性肿瘤有潜在价值的诊断标志和预后因子，其存在预示着肿瘤组织分化不良，临床分期高，5年生存率及总生存率下降，无瘤生存时间缩短，复发率增加[3，4]。survivin是肿瘤特异性的凋亡抑制蛋白，在成人大多数肿瘤组织中表达水平异常升高[5]。可采取抑制其表达或干扰其作用的策略来治疗肿瘤，其分子靶向治疗单独或与其他抗癌治疗联合应用，可抑制体外肿瘤的形成及已形成肿瘤的生长[6]。
本研究中western blot印迹试验表明survivin反义复合物可以下调t24细胞survivin蛋白表达，其表达水平随着反义复合物浓度的增加而进行性下降。提示脂质体的反义转染是成功的，反义survivin复合物可以明显下调t24细胞survivin蛋白的表达，并呈现一定的浓度依赖性。mtt结果显示t24细胞凋亡率随处理时间的延长而呈现增加趋势。流式细胞仪检测出t24细胞经反义surivin复合物处理后出现典型的细胞凋亡亚二倍体峰，且亚二倍体峰的峰值随处理时间的延长而增加。亚二倍体峰的出现与增加是量化膀胱癌细胞凋亡的客观指标，说明经脂质体转染的survivin反义寡核苷酸可诱导膀胱癌细胞发生凋亡，且凋亡细胞率有一定时间依赖性。
研究表明，survivin分子靶向治疗可通过诱发肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤新生血管形成的双重机制来发挥抗肿瘤作用[7]。高凋亡指数组患者的5年生存率明显高于低凋亡指数组，说明诱导肿瘤细胞凋亡是一种有效的抗肿瘤治疗手段[8]。本组资料表明经脂质体转染的survivin反义寡核苷酸可诱导体外培养人t24膀胱癌细胞发生凋亡，可能为膀胱癌的综合治疗提供新的方法。
【参考文献】
[1] rodel f,hoffmann j,distel l,et al.survivin as a radioresistance factor, and prognostic and therapeutic target for radiotherapy in rectal cancer[j].cancer res,2005,65(11):4881?4887.
[2] weikert s,christoph f,schrader m,et al.quantitative analysis of survivin mrna expression in urine and tumor tissue of bladder cancer patients and its potential relevance for disease detection and prognosis[j].int j cancer,2005,116(1):100?104.
[3] cohen c,lohmann cm,cotsonis g,et al.survivin expression in ovarian carcinoma:correlation with apoptotic markers and prognosis[j].mod pathol,2003,16(6):574?583.
[4] dong y,sui l,watanabe y,et al.survivin expression in laryngeal squamous cell carcinoma and prognostic implications[j].anticancer res,2002,22(4):2377?2384.
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