摘要：【目的】角蛋白10（K10）是黑色素细胞中黑素体向周围角化细胞迁移的分子标记之一,在研究基因在黑色素细胞与角化细胞相互作用的功能时,可以作为特异的启动子。本研究欲筛选K10较强的启动子片段,为研究K10以及相关基因的功能提供理论依据和奠定理论基础。【方法】从小鼠尾巴提取基因组DNA,经质量鉴定后,采用PCR法扩增K10的6个不同片段（F1—F6）,并将其分别亚克隆到p MD18-T载体,经测序验证是否正确;将K10的6个亚克隆片段再克隆到p GL0载体中,产生p GL0-F1—F6构建,用脂质体法转染293T细胞,转染结束后将细胞裂解,并通过双荧光素酶报告基因检测6个片段转染细胞后引起的荧光素酶活性变化,以筛选启动效果最好的启动子片段;用筛选到的K10启动子片段作为特异启动子,替换p GL0载体上的CMV强启动子,并与周期素依赖蛋白激酶5（CDK5）基因进行重组,形成p GL0-F-CDK5构建,用脂质体法转染小鼠皮肤角化细胞,待转染结束后,分别进行细胞爬片、细胞裂解和细胞总RNA的提取,之后用免疫荧光化学、双荧光素酶报告基因检测法和实时荧光定量PCR法检测CDK5的表达定位、表达水平及荧光素酶活性,以检测其在角化细胞中的启动效果;用生物信息法Promoter Scan分析所得到的活性最强的K10启动子片段,发现其可能的转录因子结合位点。【结果】PCR扩增、克隆得到K10启动子的6个片段（F1—F6）,片段大小分别为1 201、908、664、787、790、656 bp;质粒p GL0-F1—F6分别转染293T细胞后,通过双荧光报告检测发现长度为787bp的F4启动子活性最强;但F1—F6启动子的活性均弱于p GL0-basic中CMV的启动活性;F4序列中含有基本启动子保守区域的共同序列即TATAAAA,经Promoter Scan分析发现F4序列中含有C/EBPβ、GATA、HSF、CAP等多个转录因子的结合位点,这些位点利于K10在角化细胞中表达;p GL0-F4-CDK5转染角化细胞后,�

关键词：角蛋白10 启动子 特异启动子 转录因子 cdk5 

单位：山西农业大学动物科技学院; 山西太谷030801