摘要：目的：利用AdEasy腺病毒载体系统,构建小鼠降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide,CGRP）基因重组腺病毒载体,并验证其在心肌细胞中的表达。方法：采用RT-PCR方法扩增出含有小鼠CGRP全长cDNA的基因片段,并将其插入PUC57载体,经EcoRⅤ和SalⅠ双酶切,将小鼠CGRP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,形成重组质粒pShuttle-CMV-CGRP。经Pm eⅠ酶切线性化后,在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组产生重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP。重组腺病毒质粒在XL-Gold细胞中扩增,经PacⅠ酶切线性化后,转染人胚肾293细胞进行重组腺病毒的包装,并经氯化铯纯化得到重组腺病毒AdEasy-pShuttle-CGRP。用纯化后的重组腺病毒转染原代培养的乳鼠心肌细胞,荧光显微镜下观察转染效果。通过尾静脉导入重组腺病毒7 d后,放免法测定心肌中CGRP的表达量。结果：测序证实PUC57-CGRP重组质粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重组穿梭质粒pShuttle-CMV-CGRP经双酶切鉴定后可见约7.5 kb和423 bp片段;重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP经PacⅠ酶切可见长约3kb与30 kb DN断。转染293细胞进行包装,7 d后细胞出现病变效应,回收病毒重复感染293细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达。提取病变293细胞中重组腺病毒进行目的基因的PCR鉴定为阳性。构建好的重组腺病毒经纯化后具有很高的滴度,并且成功转染了原代培养的乳鼠心肌细胞。通过放免法证实,该载体可以显著增加小鼠心脏中CGRP的表达。结论：成功构建携带CGRP基因的重组腺病毒载体,该重组腺病毒载体AV-CGRP可以显著增加心脏中CGRP的表达量,为进一步研究CGRP基因治疗奠定了基础。

关键词：降钙素基因相关肽 重组 遗传 遗传载体 基因表达 

单位：浙江大学医学院附属第一医院心血管内科 浙江杭州310003